Membrane transducing activity of recombinant Hoxc8 and its application as a delivery vector

Abstract

[한글]세포막이 투과성을 낮추는 장벽 역할을 하기 때문에 대부분의 고분자는 살아 있는 세포에 의해 활발히 이입되지는 않는다. 그러나 최근 단백질 transduction 도메인(PTD)이 지질층으로 이루어진 세포막을 통과하여 세포 내부로 도입되어질 수 있다는 것이 보고되었다. 가장 활발히 연구된 PTDs로는 인체면역결핍 바이러스(HIV-1)에서 얻어진 전사 조절 단백질 Tat와 초파리 전사 인자인 Antennapedia(Antp)가 있다. Antennapedia와 같이 Hoxc8은 호메오도메인을 포함하는 단백질이며 이것은 60개의 아미노산으로 구성되어 있다. 호메오도메인은 세 개의 α-helix를 갖고 있으며 2번째와 3번째 helix 사이에 β turn이 존재하며, 이 세 번째 α-helix가 PTD의 속성을 갖고 있음이 알려져 있다. 본 연구에서는 여러 종류의 재조합 Hoxc8 단백질을 제작하고 이들 각각의 PTD로서의 기능 및 핵산과 같은 고분자 물질의 세포내 도입 등을 분석하였다.세 종류의 Hoxc8 단백질(Hoxc81-242, Hoxc8152-242, Hoxc8149-208)을 glutathione S-transferase (GST)와 융합되어 대장균 내에서 발현하도록 제작하였으며 pGEX 4T-1에 클론하여 IPTG로 발현을 유도하고 또 glutathione agarose bead를 이용하여 이 단백질 분리 정제가 용이하도록 했다: GST:Hoxc81-242는 Hoxc8 단백질 전체를 포함하고 있으며, GST:Hox8152-242는 Hoxc8의 N-term을 제거하여 호메오도메인과 산성 아미노산이 많이 존재하는 C-term을 포함하고 있으며, GST:Hoxc8149-208은 호메오 도메인만을 포함한다. 단백질들은 Oregon 488을 이용하여 형광 표지한 후 PPFF와 T98G 세포에 처리 한 후 형광 현미경에서 단백질의 세포내 도입을 분석하였다.결과 세 종류의 재조합 단백질 모두 비슷한 효율을 가지고 세포 안에 들어가는 것이 관찰이 되었다. 그리고 DNA-단백질 복합체 형성 실험에서는 음전하를 띄는 부분을 가지고 있는 단백질인 GST:Hoxc8152-242 에서는 매우 낮은 효율로 DNA-단백질 복합체를 형성했고, Hoxc8 단백질 전체를 다 갖고 있는 단백질보다는 호메오도메인만을 갖고 있는 GST:Hoxc8149-208 단백질이 매우 효율적으로 복합체를 형성하였다. 그 다음 이 DNA-단백질 복합체를 세포에 처리하여 Hox 단백질과 함께 도입된 DNA(pDsRed1-C1)의 세포 내 전달을 확인하였다. 이상의 결과는 재조합 Hoxc8 단백질을 이용하여 단백질이나 핵산 같은 생체 고분자 물질의 세포내 도입이 가능함을 제시해 주었으며 이는 더 나아가 치료용 물질의 전달 벡터로서의 개발 가능성을 보여 주었다.

[영문]All macromolecules are not actively taken up by living cells as its impermeability. The observation of protein transduction domain (PTD) has triggered its excitement. Since then, the most actively studied PTDs are those derived from the human immunodeficiency virus (HIV-1) transcriptional regulator Tat and the Drosophila transcription factor Antennapedia (Antp), that shown a rapid cellular delivery of proteins and peptides. Like Antp, Hoxc8 is one of the homeodomains that encodes protein domain of 60 amino acids, which is composed of three α-helices, with one β turn between helix 2 and 3 and that helix 3 is known to have translocation properties. Therefore, this is to study the transducing activity of recombinant Hoxc8 and its application as a delivery vector in membrane.Hoxc8 full gene (pGEX:Hoxc81-242) was obtained from mouse RNA and prepared as a cDNA. By cloning technique, homeobox of Hoxc8 with acidic portion could be isolated and named as pGEX:Hoxc8152-242 with homeobox only of pGEX:Hoxc8149-208. Recent paper have reported that PTD that contains purely basic amino acids is more efficient. Therefore, the third clone consisted with homeobox only which showed to contain basic amine groups. The proteins were labeled Oregon 488 and labeled proteins were treated to cells.Similar efficiency in protein transduction was seen in all those three recombinants. In the DNA-protein complex formation experiment, the construct with basic amine group was more efficient and also the negative charge portion at the C-terminus suppressed from the DNA-protein complex binding. It has been shown that the protein indeed enters cells with macromolecules and the macromolecules were able to translate and work inside the cell.This opens a great promise as a tool for a delivery vector with some modifications it may become alternatives for the replacement of liposomes or viral vectors that are toxic or may produce immune reaction from the targeted cell.