Identification of a lipoprotein of Vibrio vulnificus as an immunostimulant inducing cytokine production of human monocytes

Abstract

[한글]패혈증 비브리오균 (Vibrio vulnificus) 은 그람 음성의 미생물로 음식물 섭취를 통하여 위장염과 같은 소화기관의 감염과 피부 접촉으로 인한 감염으로 인체에 침입하여 괴사성 상처감염을 일으키고 패혈증을 유발한다. 패혈증 비브리오균에 의한 패혈증은 전형적인 패혈증성 쇼크, 그리고 극심한 염증성의 사이토카인 반응을 나타낸다.본 연구에서는 패혈증 비브리오균의 표면 단백질 중 하나인 lipoprotein이 숙주 내에서 innate inflammation을 유도하는 지를 조사하고자 하였다.패혈증 비브리오균의 lipoprotein을 생성해내는 lpp 유전자를 제거한 돌연변이를 만들어 연구에 사용함으로써, 이 단백질이 인체세포에서 염증반응에 관여하는 사이토카인 중의 하나인 Interferon-γ (IFN-γ)가 유도되는데 있어 중요하다는 것을 알았다. 이를 바탕으로 하여, 패혈증 비브리오균의 lipoprotein에 대한 숙주세포 내에서의 반응을 조사하기 위하여 재조합단백질을 합성하였다. [3H]-palmitic acid 을 이용하여 박테리아 내에서 lipoprotein에 표지함으로써, native form의 lipoprotein의 특성 중의 하나인 lipidation 되는 과정을 재조합단백질 역시 거치게 된다는 것을 확인하였다. 합성된 재조합단백질을 이용하여 인체세포에 반응시킨 결과 염증반응에 관여 하는 tumor necrosis factor- (TNF-α)와 Interleukin-6 (IL-6)이 생성되지만 IL-4는 생성되지 않는다는 것을 알았다.Lipoprotein은 아미노기 말단 (NH2-terminal)에 lipo-amino acid 즉 N-acyl-S-acylglyceryl cysteine이라는 특이한 부분을 가지고 있다. 본 연구에서는 lipoprotein의 이런 특징적인 구조가 인체세포에서의 면역반응을 일으키는데 중요하게 작용하는지에 대해서도 조사하였다. 그 결과 lipidation되지 않는 lipoprotein은 lipidation된 lipoprotein에 비해 인체세포에서 사이토카인 생성을 유도하는 능력이 많이 저하되는 것을 확인하였다. 이로서 단백질의 lipid 부분이 사이토카인 생성을 유발하는데 있어 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.Lipoprotein이 인체세포와 반응할 때, Toll-like receptor (TLR)를 통하여 일어나는 지의 여부를 조사하였다. TLR2 항체를 이용하여 인체세포에 재조합 lipoprotein으로 자극시키기 전에 TLR2 항체를 처리한 세포에서는 TNF- 와 IL-6의 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 그리고 재조합 lipoprotein에 의해 유도되는 사이토카인 생성에 있어 TLR2의 역할을 좀 더 확인하기 위하여 TLR2가 발현되는 세포와 TLR4가 발현되는 세포를 이용하여 NF-κB의 활성도를 측정한 결과, TLR2가 발현되는 세포에서만 재조합 lipoprotein에 반응시켰을 때, NF-κB의 활성도가 높게 측정되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 패혈증 비브리오균의 lipoprotein이 인체세포에서 TLR2를 활성화시켜 면역자극제로서의 기능을 할 것이란 기대를 가능하게 한다.

[영문]Vibrio vulnificus is a gram-negative pathogenic bacterium causing primary septicemia, necrotizing wound infections, and gastroenteritis, especially in immunocompromised humans. Primary septicemia caused by V. vulnificus appears to follow a classical septic shock pathway including an overwhelming inflammatory cytokine response resulted in multi-organ failure and death. In this study, I identified a putative lipoprotein (Lpp) encoded by the lpp gene as one of the surface proteins of V. vulnificus. Using a mutant V. vulnificus in which its lpp gene had been knocked out, I found that Lpp is important in production of interferon-γ (IFN-γ) in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Production of tumor necrosis factor- (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6), but not of IL-4, is induced by the recombinant Lpp (rLpp) in human monocytes. Lipidation of the rLpp protein made in Escherichia coli was confirmed by in vivo labeling with [3H]-palmitic acid. Experiments using the mutant Lpp unable to be modified by lipidation indicate that lipidation of Lpp is an essential property in cytokine production of human monocytes. A possibility that cytokine production was caused by LPS contamination present in rLpp was excluded in the experiment using polymyxin B-treated rLpp. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in Lpp-induced cytokine production was confirmed by two different in vitro assays. Pretreatment of monocytes with antibodies against TLR2 inhibited production of TNF- and IL-6. TLR2-expressing cells but not TLR4-expressing cells showed a dramatic increase in NF-κB activity. These results suggest a possibility that the Lpp of V. vulnificus exerts its function as an immunostimulant to human monocytes by activating TLR2.