배아줄기세포에서 분화시킨 도파민 신경세포의 N-type Ca2+ 채널 형성과 도파민분비

Abstract

[한글]파킨슨씨병은 중뇌의 흑색질 치밀부(substantia nigra pars compacta, SNpc)에 있는 도파민신경세포의 손실에 의해 나타나는 대표적인 신경퇴행성 질환이다. 예전부터 파킨슨씨병을 치료하기 위한 연구가 진행되어 왔으며, 최근에 세포치료의 새로운 재료로 줄기세포가 대두되어 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구실에서도 쥐의 배아줄기세포에서 분화시킨 도파민 신경세포(또는 전구체)를 파킨슨씨병 동물모델의 선조체에 이식한 후, 운동 기능 회복을 확인한 논문을 발표하였으며, 꾸준히 배아줄기세포를 이용한 파킨슨씨병 치료가능성이 동물모델을 통해 확인되어지고 있다. 그러나 배아줄기세포로부터 분화시킨 도파민 신경세포가 생체내로 이식 후 어떠한 세포 생리학적인 메커니즘을 통해 도파민을 분비하는지에 관한 연구는 미비한 실정이다. 도파민 신경세포에서 도파민의 분비는 세포막의 탈분극에 의해 Ca2+ 채널이 열려 이를 통해 세포외부에서 유입된 Ca2+ ions에 의해 유도된다. 이에 본 연구는 쥐의 배아줄기세포에서 분화시킨 도파민 신경세포에서 전기생리학적인 방법과 면역염색법을 통해 Ca2+ 채널과 도파민 분비와의 관계를 알아보고자 하였다. Ca2+ ratiometic 〔Ca2+〕i 측정법을 통해 막전압 탈분극에 의한 세포내 Ca2+ 농도의 증가를 확인하고, HPLC를 통해 도파민의 분비량이 증가한 것을 관찰함으로써 세포내 유입된 Ca2+ ions이 도파민의 분비에 관여하는 것을 알 수 있었다. 반면에, N-type Ca2+ channel blocker인 ω-conotoxin GVIA를 KCl과 같이 처리한 그룹은 KCl만 처리한 그룹보다 도파민 분비량이 감소한 것으로 보아, 쥐의 배아줄기세포에서 분화한 도파민신경세포에 N-type Ca2+ channel이 형성되어 기능을 하고 있음을 알 수 있었다. 또한 Whole cell 막전압 고정법과 형광면역염색을 통해서도 N-type Ca2+ channel이 형성된 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼때, 쥐의 배아줄기세포에서 분화시킨 도파민신경세포에 N-type Ca2+ channel이 형성되어 도파민의 분비에 관여함을 알 수 있다.

[영문]Parkinson's disease (PD) is the most common neurodegenerative disease caused by loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the midbrain. For decades there have been many attempts to develop proper treatments for this disease. Recently, with the new technology of stem cells, research on cell therapy has been accelerated. We have also confirmed the recovery of motor function after implanting dopaminergic neurons (or precursors) derived from mouse embryonic stem (ES) cells into striatum of PD animal models, as feasible treatments applying stem cell technology have been identified. However, the physiological mechanism of dopamine (DA) release in response to transplantation of dopaminergic neurons derived from mouse ES cells is uncertain. DA release in dopaminergic neurons is induced by Ca2+ ion influx through Ca2+ channels in response to membrane depolarization. Herein, the purpose is to elucidate the relationship between Ca2+ channels and DA release in dopaminergic neurons derived from mouse ES cells by electrophysiological experiments and immunostaining. Firstly, the attempt to clarify the increase in DA release observed by HPLC made it clear that the influx of Ca2+ ions induced DA release. Secondly, decrease in DA release was observed with conotoxin GVIA (N-type Ca2+ channel blocker) with a KCl group compared to the KCl group only. This implies that the N-type Ca2+ channels formed in dopaminergic neurons derived from mouse ES cells function properly. Furthermore, N-type Ca2+ channels were identified with the whole cell patch clamp technique and immunofluorescence-staining. These results lead to the conclusion that the N-type Ca2+ channels were formed in dopaminergic neurons derived from mouse ES cells and that Ca2+ channels activated by Ca2+ ion influx in response to membrane depolarization caused DA release.