분해된 DNA 검체 분석을 위한 새로운 miniSTR multiplex 검사방법 구축과 유용성 평가

Abstract

[한글]

짧은연쇄반복(short tandem repeat; STR)에 기초한 다중중합효소연쇄반응체계(multiplex PCR system)는 법의학 분야에서 유전자형을 분석하기 위한 유용한 도구로 사용되어 왔다. 한편, 고도로 분해된 법의 검사물은 기존의 다중중합효소반응체계를 사용하여 분석할 경우 유전자형을 결정하는데 어려움이 있었기 때문에, 최근에는 기존의 CODIS STR 유전자 좌의 중합효소연쇄반응의 증폭산물 크기를 작게 만들어 PCR의 효율을 높이는 miniSTR을 개발하여 이와 같은 문제를 해결하고자 하였다. 뿐만 아니라, CODIS STR에 추가하여 사용할 수 있는 새로운 miniSTR 유전자 좌의 다중중합효소연쇄반응 체계를 구축하고, 그에 대한 집단유전 분석 결과를 보고 하는 등 miniSTR에 대한 관심이 높아지고 있다. 한국인에서도 그간 STR를 대상으로 다중중합효소연쇄반응에 관한 많은 연구가 행해져왔으나, miniSTR에 관한 연구는 거의 없어 miniSTR에 대한 다중중합효소연쇄반응 체계를 구축하고, 새로운 STR 유전자 좌에 대한 집단유전 분석 결과를 확보할 필요가 있을 것으로 생각되었다.이에 본 연구에서는 최근 보고 된 2개의 non-CODIS STR multiplex PCR system (NC01과 NC02)에 해당하는 6개의 miniSTRs (D1S1677, D2S441, D4S2364, D10S1248, D14S1434, D22S1045)과 3개(D3S3053, D6S474, D20S482)의 새로운 miniSTRs인 NC03에 대한 중합효소연쇄반응체계를 구축하였다. 구축된 세 개의 중합효소연쇄반응 체계는 9948 표준 DNA를 사용하여 민감도 분석을 시행하였고, DNase I을 처리하여 인위적으로 분해한 DNA와 50년 이상 경과된 유해 30구에서 추출한 DNA를 사용하여 효율성에 관한 분석을 시행하였다. 또한, 한국인 300명을 대상으로 9개의 새로운 miniSTR 유전자 좌에 대한 집단유전 분석을 수행하였다.본 연구에서 구축되어진 3개의 중합효소연쇄반응 체계를 사용하여 민감도 분석을 시행한 결과, 9개의 miniSTR 유전자 좌 대부분은 50 pg의 DNA에서도 기준이 되는 유전자형과 일치하는 정확한 유전자형 결정이 가능하였으며, 일부 유전자 좌는 30 pg의 DNA에서도 우수한 민감도를 나타내어 미량의 시료에서도 대립유전자형을 결정할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 분해된 DNA 시료에서의 효율성 분석결과 D4S2364, D3S3053, D14S1434 그리고 D1S1677이 우수한 유전자형 획득률을 나타내어 실제 법의 실무에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예상 되었다. 집단유전 분석 수행결과, 5개(D10S1248, D2S441, D22S1045, D14S1434, D6S474) 유전자 좌의 개체식별력과 평균부권배제력이 CODIS STR 유전자 좌에 뒤지지 않아 개인식별에 있어 뛰어난 STR임을 확인 할 수 있었다.따라서 본 연구는 한국인에서의 분해된 시료에서도 믿을 만한 결과를 획득할 수 있는 9개의 miniSTR 유전자 좌의 검사체계를 구축하였고, 한국인에서의 대립유전자의 발현 빈도와 집단유전 통계 값을 제시함으로써 앞으로 법의 실무에서 유용하게 사용할 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]Short Tandem Repeat (STR) analysis using multiplex PCR system has become a valuable tool for forensic DNA typing. However, for highly degraded DNA samples of forensic casework, full genetic profiles are not always obtainable by applying common multiplex PCR systems. To solve these problems, a new set of PCR primers for CODIS STRs known as miniSTR system which increase the PCR efficiency by reducing the size of target products has been recently suggested. Additionally, the development and population study for new STR miniplex PCR system which would be used to supplement the current battery of CODIS STRs have also been published. Several Korean population data on CODIS STRs also have been reported, but not for new miniSTR system. Accordingly, it may be needed to evaluate newly developed miniSTR system and perform population study in Koreans.We have developed the three new miniplex system (NC01, NC02, and NC03) for 9 STRs, D1S1677, D2S441, D3S3053, D4S2364, D6S474, D10S1248, D14S1434, D20S482 and D22S1045. As previously published, NC01 (non-CODIS STR 01) and NC02 consist of D10S1248, D14S1434, and D22S1045, and D1S1677, D2S441, and D4S2364, respectively. NC03 comprise D3S3053, D6S474, and D20S482, the primers for which were newly designed in the present study. To assess the sensitivity of three miniplex systems, we conducted multiplex amplification using serially diluted 9948 standard DNA, and to evaluate the efficiency of three multiplex systems, we used enzymatically digested DNA and 30 samples of 50-year old skeletal remains. Then, we carried out population study for the 9 miniSTR loci in 300 Koreans.Sensitivity test demonstrated that the genotyping results of most nine miniSTRs are reliable for 50 pg of DNA and some have good sensitivity even for 30 pg of DNA. Efficiency test showed that D4S2364, D3S3053, D14S1434 and D1S1677 produced more useful DNA profiles than other STRs for enzymatically digested DNA and 50-year-old skeletal remain samples. Statistical parameters (power of discrimination values and mean exclusion chance) showed that 5 STR loci (D10S1248, D2S441, D22S1045, D14S1434 and D6S474) are as highly informative as CODIS STRs. It implies that they are useful STR markers for forensic human identification.MiniSTR multiplex sets (NC01, NC02, and NC03) in the present study proved to be a useful tool which can produce a reliable DNA profile even in degraded samples. The results on allele frequency distributions and statistical values at 9 miniSTR loci also suggested that they can provide a valuable information for forensic casework in Koreans.