백서에서 임신 중 레티노산이 구개형태 발생에 미치는 영향

Abstract

[한글]백서에서의 구개발생은 배자 발생 14일째에 입천장선반(palatal shelves)이 아래쪽으로 자라며 시작한다. 발생 16일째가 되면 아래쪽으로 자라던 입천장선반이 혀 위쪽으로 이동하게 되고, 중앙을 중심으로 입천장선반의 가운데부분부터 병합하여 발생 17일째가 되면 앞뒤부분까지 병합이 완료된 완전한 구개가 형성된다. 레티노산은 비타민 A의 생체 내 활성 대사산물로써 일반적으로 배자 발생에 있어 배자의 전후 축(anteroposterior axis) 형성과 중추신경계 형성 등에 관여한다고 알려져 있다. 그러나 이러한 레티노산에 과다히 노출되거나 결핍되면 기형이 유발되고, 발생과정 중 배자 축 형성에 관여한다고 알려진 Hox 유전자의 발현 또한 조절한다고 보고되어 있다.본 연구에서는 임신 11일째 백서에 레티노산을 복강내 주사로 주입하고 발생 13일부터 17일까지의 배자를 분리하여 배자의 형태적 변화를 관찰하고, 또 분자 수준에서 배자 머리 부분에서 발현하는 유전자를 분석하였다.실험 결과 형태적으로는 레티노산에 노출된 배자의 경우 정상 배자에 비해 머리 발생 지연을 포함하여 머리둔부길이(CRL)와 사지 등의 길이가 짧아진 것이 보였다. 또 17일째 배자의 경우 정상 배자에서는 완전한 구개가 형성되었으나 레티노산에 노출된 배자에서는 총 52예의 배자 중 36예에서 구개열이 관찰되었으며, 구개열의 벌어진 간격은 약 0.80±0.36 mm이었다. 역전사 중합효소 연쇄반응 방법을 이용하여 Hox 유전자의 발현 양상을 비교해 본 결과, 정상 배자에서 Hoxa7은 발생 13일째에 가장 강하게 발현한 후 점차 약해지는 양상을 보인 반면 레티노산에 노출된 배자에서는 발생 13일에 비해 15일째에 발현이 현저히 증가한 후 차츰 감소하였다. 반면, Hoxc8은 발현이 전반적으로 약하였으며, 정상 배자의 경우 발생 16일째에 발현이 감지된 반면, 레티노산에 노출된 배자에서는 정상 배자보다 조금 빠른 발생 15일째에서 약한 발현이 관찰되었다. 또, 세포사멸에 관여하는 Bcl 가족 유전자(family gene)의 경우 정상 배자에서는 발생 13일에서 17일까지 anti-apoptotic한 유전자인 Bcl-xl과 Bcl-2, 그리고 pro-apoptotic한 유전자인 Bax 모두 강하게 발현하였으나, 레티노산에 노출된 배자의 경우 Bcl-xl과 Bcl-2의 발현이 발생 16일 이후에는 감소하였으며 반대로 Bax의 경우는 발생 13일에서 15일까지 매우 저하되었다.이상의 결과로 미루어 보아 임신 중 레티노산이 배자 발생과정 중 구개열을 포함한 형태적 기형 유발을 가능하게 할 수 있는 물질임을 알 수 있었고, 또 배자형태 발생에 관련된 Hox 유전자의 발현과 세포사멸에 관련된 Bcl 가족 유전자인 Bcl-xl과 Bcl-2, 그리고 Bax 유전자의 발현을 조절하여 배자의 형태적 기형 유발에 관여할 것으로 생각된다.

[영문]Palatogenesis begins from day 14 to day 17 during the rat embryogenesis. Palatal shelves grow vertically from day 14 until the beginning of day 16 of the embryo. Subsequently, the palatal shelves elevate horizontally to the level of tongue, grow medially, and then fuse together in the midline to be connected with nasal septum. Retinoic acid (RA) is an endogenous metabolite involved in the formation of anteroposterior axis during the embryonic development. It is known that excess or deficiency of RA is involved with the embryonic malformation. Hox gene is known as a master regulator involved in the pattern formation during embryogenesis. It is also reported that the ectopic expression of Hox generates an abnormality in craniofacial region with the cleft palate.In this study, we injected RA intraperitoneally into the pregnant female rat on day 11 of its pregnancy, and then embryos in the stages between day 13 to day 17 of gestation were isolated consequently. The palate morphology was analyzed by the microscopic method. The expression patterns of Hox and several programmed cell death genes were studied by using RT-PCR.For the morphological study, the retardation of craniofacial region, the shortage of crown rump length and limbs were analyzed in the RA-treated embryos. In the RA-treated embryos of day 17, it was observed that the palatogenesis was completely finished just like in the normal embryos. However, the cleft plate was observed in 36 out of 52 total samples with the distance of 0.80±0.36 mm in average. The temporal expression pattern of Hox genes through RT-PCR revealed that the expression of Hoxa7 reached its peak on day 13 then slowly declined in the normal embryos. Whereas in the RA-treated embryos, the expression peak was observed on day 15, then declined subsequently. With the Hoxc8 gene, its expression was low in all stages until the day 16 of normal embryogenesis. On the other hand, Hoxc8 gene expression was detected slightly early on day 15 in the RA-treated embryos. In the study of Bcl-family genes, uniformly strong expression of anti-apoptotic and pro-apoptotic genes was observed from day 13 to day 17 of normal embryos, whereas anti-apoptotic gene expressions were decreased after day 16 in the RA-treated embryos. Additionally, a dramatic decline of pro-apoptotic gene expression was observed from day 13 to day 15 of the RA-treated embryos.Therefore, we believe that RA is a potential factor that is actively involved in the cleft palate formation. Moreover, it is profoundly linked with the regulation of Hox and Bcl family gene expression pattern that leads to the embryonic malformation.