TAT-Protein Transduction Domain을 이용한 BMP-7의 전달과 생물학적 효과

Abstract

[한글]구강 및 악안면 영역에서 골 형성 유도는 중요한 임상적 의의를 갖는다. 이를 위해 지금까지 다양한 매개체와 인자 개발이 이루어져 왔다. 특히 BMP와 같은 생물학적 활성 단백은 골 형성 유도에 가장 우수한 효과를 보이지만, 이의 경제성과 수용성(soluble in nature)으로 인한 이차적인 문제를 야기하였다. 따라서 본 연구는 세포내로 자발적 투과가 가능한 단백질 전달 영역(Protein transduction domain: PTD)을 가진 HIV-1 TAT 펩타이드를 이용하여 재조합 BMP-7을 박테리아에서 생합성 및 정제하였고, 이들의 세포내 투과성과 세포내 processing 과정, 활성 BMP-7의 효과를 in vivo에서 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.1. 박테리아에서 발현하여 분리 정제된 TAT-BMP-7 융합 재조합 단백질은 농도, 시간 및 온도 의존적인 방식으로 세포내로 전달되었다. 이러한 전달은 다양한 세포에서 일관되게 관찰되어 이는 재조합 단백질이 수용체를 통하지 않고 세포막을 투과한다는 것을 제시하였다. 또한 TAT-BMP-7의 이러한 세포막 투과 과정은 TAT 아미노산 배열에 의존적이었다.2. 세포내부로 전달된 TAT-BMP-7는 세포질에 주로 존재하였고, 특히 세포 내 부의 스트레스 섬유인 F-actin과 특이적으로 결합하고, 이러한 결합이 TAT 아미노산 배열에 의한 것임을 알 수 있었다.3. TAT-BMP-7은 proprotein convertase인 furin에 의해 절단됨을 확인하였고, 또한 세포내에서 α1-PDX에 의한 furin 억제는 세포내에 전달된 PTD-BMP -7의 활성화 반감기를 증가시키고, 이는 furin에 의한 절단과정이 활성화 BMP-7의 분비에 결정적인 역할을 한다는 것을 의미하였다. 4. 세포내로 전달된 TAT-BMP-7은 간엽기원 세포의 ALPase 활성을 증가시켰 고, 나아가 실험동물의 대둔근에서 이소성 석회화 유도의 가능성을 확인하였 다.본 연구에서 이상과 같은 결과로 TAT PTD 재조합 BMP-7 단백질을 박테리아에서 대량 생산하여 세포내로 성공적으로 전달하였고, 전달된 TAT-BMP-7은 F-actin과 결합하여 재구조화 (refolding) 과정과 furin에 의한 절단 과정을 거쳐 활성화 BMP-7을 분비하였다. 향후 TAT-BMP-7의 전달 및 활성화 단백질 분비 기전에 대한 연구와 함께 골 결손 모델이나 개체 발생 모델을 이용한 다양한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

[영문]The purpose of this study was intracellular transduction of PTD, derived from HIV TAT sequence, fusion BMP-7 by which biosynthesis of bacterial recombinant protein and purification. And its intracellular processing and biologic function were studied. The results were as follows; 1. Recombinant TAT-BMP-7 protein, obtained from bacterial expression and purification, was successfully transduced into the cells by concentration- and time-dependent manner. This transduction was consistently observed among the various cell type, suggesting that this process was not required the membrane receptor. The transduction was TAT-dependent process.2. Transduced recombinant protein was mainly localized in the cytoplasm, especially the protein was selectively binds to stress fiber F-actin. This binding was also dependent on TAT sequence.3. Recombinant TAT-BMP-7 contains proprotein convertase cleavage site at amino acid 289~292, and this site was cleaved by proprotein convertase furin. And the over-expression of α1-PDX to inhibit furin resulted in increased half-life of transduced TAT-BMP-7, suggesting that furin cleavage is critical for intracellular processing and following secretion of active BMP-7. 4. Transduction of TAT-BMP-7 into the mesenchymal cells induced alkaline phosphatase activity, and furthermore the direct injection of the protein into the skeletal muscle of mice resulted in ectopic calcification.These results demonstrate that TAT PTD recombinant BMP-7 obtained from bacteria mass production was successfully transduced into the cells. The transduced protein was selectively binds to F-actin and following refolding, furin cleavage process was proceed to secretion of biologically active BMP-7. Further study for the cellular mechanisms of intracellular transduction to secretory process and variable animal study may elucidate the possibility of clinical potential of this protein.