DHPLC를 이용한 Duchenne 형 근이영양증 보인자 검색 방법

Abstract

[한글]Duchenne muscular dystrophy (DMD) 는 소아에서 발병하는 가장 흔한 근육 질환의 하나로, 남아 3500명중의 1명꼴로 발생한다. DMD 유전자는 염색체 Xp21 위치에 2.4 Mb 크기로 존재하며, dystrophin 단백질을 만드는 작용을 한다. Dystrophin 유전자는 79개의 엑손을 가지고 있고 mRNA 크기는 약 14kb에 달하며, 이제까지 밝혀진 사람의 유전자 중에서 가장 크다. 또한 전체 환자의 약 65%는 DMD 유전자의 한 개 이상의 엑손의 결실로 인한 기능적 이상으로 인하여 발생한다. 따라서 임상적으로 가장 많이 활용되는 DMD 환자의 진단 방법으로는 multiplex PCR (polymerase chain reaction) 을 이용하여 DMD 유전자의 결실을 확인하는 것이다. 또한 전체 환자의 2/3 의 경우 유전적 요인에 의하여 발병하므로 산전 진단 등의 임상적 목적으로는 보인자의 진단이 매우 중요하다. 보인자를 진단하기 위한 기존의 방법들은 southern blot analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH), polymorphic short tandem repeat (STR) analysis, end point quantitative PCR and real-time quantitative PCR 분석법 등이 있다. 이들 방법은 동위원소를 사용하거나, 시간이 많이 걸리거나, 고가의 장비를 요하는 경우 등의 문제가 있다. 따라서 본 연구에서는 DHPLC를 이용한 새로운 유전자 검사 방법을 개발하여 이러한 임상적 문제를 해결해 보고자 하였다. 본 연구에서 개발된 새로운 방법은 결실이 있는 부위를 PCR 증폭 후 DHPLC 결과로 비교하여 보인자에서 해당 부위의 결실 여부를 확인하는 방법으로서 가족의 검체 없이도 internal-control 과의 비교를 통해서 환자나 보인자의 이상 유무를 진단해 낼 수 있었다.검사 대상은 10명의 정상여성과 1명의 정상남성, 37명의 DMD 환자, 그리고 15명의 환자의 어머니를 포함하였다. Dystrophin gene 내에 결실이 확인된 Exon 3, 44, 45, 48, 52 부위를 증폭하였으며 정확한 PCR 의 여부와 유전자 copy의 비율 측정을 위하여 X 염색체상의 G6PD 유전자를 control로 이용하여, DMD 유전자 각 exon primer와 함께 multiplex-PCR 후 DHPLC의 분석을 통해 보인자 여부를 확인하였다.DHPLC 분석 결과, 두 가지 형태의 결과를 관찰할 수 있었으며 비교 결과 DHPLC 를 이용한 정량 분석법은 보인자와 정상여성 사이에서 확실한 차이를 보였다. DHPLC 를 이용한 DMD gene 의 보인자 검색방법은 간단하고 빠르며 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 이러한 결과는 DMD와 비슷한 기전을 보이는 다른 유전질환의 경우에서도 보인자 진단에 도움을 줄 수 있을 것이다

[영문]Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD) affect 1 in 3500 newborn male infants. DMD and BMD are both inherited in X-linked recessive pattern resulting from mutations in the dystrophin gene on Xp21.1. The disease caused by de novo mutations within the gene in one-third of the patients. Approximately 60% of the patients are associated with large intragenic deletions of one or more exons within 2 hot-spot regions in the proximal and central regions of the gene (exons 3, and exons 44？52). Affected males can be readily detected by the absence of an amplification product in a multiplex PCR. Up to 98% of all frequent deletions can be detected using multiplex PCR. For the diagnosis of carriers, multiplex PCR cannot be used because the gene in the non-deleted X chromosome also produce PCR product for the deletion. Several DMD carrier identification strategies based on quantitative Southern blotting, fluorescent in situ hybridization, linkage analysis have been described. In this study, a simple, rapid, non-gel-based, non-fluorescence-based method for detecting female carrier of DMD by DHPLC is descrided. In total, 37 patients with deletions in different part of the gene, 15 carrier mothers and 10 female controls were analysed. Gene dosage of the deleted region was determined after multiplex PCR followed by DHPLC analysis. It was possible to discriminate among patients, carrier mothers and normal controls by comparing absorbance values. The ratio between peaks of carriers and internal controls showed the range from 0.6 ~ 1.15. This method is fast, easy and reproducible for detecting deletions in DMD carriers in practice. The method might also be useful for the diagnosis of other diseases that carry a deletion as a mechanism of the diseases such as microdeletion syndromes.