The apoptotic effect of the Pleurospermum kamtschaticum extract and its active component, buddlejasaponin Ⅳ

Abstract

[한글]대장암은 세계적으로 가장 흔한 악성 암 중에 하나로서 식생활이 서구화되어 가면서 우리나라에서도 매년 발생률이 현저히 증가되고 있다. 최근 독성이 없고 효능이 뛰어난 화학적 암 예방제를 야채, 과일, 약용식물 등의 천연자원으로부터 개발하기 위해 많은 연구가 진행되고 있다. 누룩치는 한국 강원도에 자생하는 식물로서 예부터 감기, 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 무기력증에 효과가 있다고 알려져 있다. 또한, buddlejasaponinⅣ (BS-Ⅳ)은 누룩치 지상 부 추출물에서 분리된 활성성분으로 항바이러스 활성과 간 보호 효능을 가지고 있다고 알려져 있다. 그러나 누룩치 및 BS-Ⅳ 의 암 예방 및 항암효능 및 작용기전에 대한 연구는 현재까지 되어진 것이 없다.세포가 생존하기 위해서는 세포가 세포외 기질에 부착하여 세포외 기질과 세포간의 상호작용 (interaction)이 필요하며, 세포 부착의 소실은 세포사멸의 원인 중 하나이다. 최근 α2β1 integrin 발현의 감소가 대장암세포의 세포사멸을 일으킨다고 보고가 되어 있다.본 연구에서는 누룩치 지상 부 추출물 및 BS-Ⅳ를 대장암에 대한 암 예방제로 개발하기 위해, 사람 대장암세포주인 HT-29 세포에서 누룩치 추출물과 BS-Ⅳ의 integrin 매개 세포신호전달계를 중심으로 작용기전을 조사하였다. 더 나아가 암전이 유도 동물 모델에서 암 전이를 억제하는지를 조사하였다.누룩치 추출물은 대장암세포인 HT-29 세포의 생존률을 용량 의존적으로 감소시켰으며, 핵의 농축, DNA의 분절, phosphatidylserine의 유리를 유도하였다. BS-Ⅳ 역시 세포의 생존률을 감소시키고 DNA의 분절을 일으키는 것을 확인하였다. 누룩치 추출물과 BS-Ⅳ는 Bax/Bcl-2의 비율을 증가시키고 pro-caspase 3와 pro-caspase 9를 활성화시킴으로써 PARP의 분절을 유도하였다. 이러한 결과로 누룩치 추출물과 BS-Ⅳ가 미토콘드리아에 의존적으로 세포사멸을 유도한 것을 확인하였다.누룩치와 BS-Ⅳ는 세포외 기질의 단백질 성분인 collagen Ⅰ,Ⅳ 그리고 laminin에 대한 대장암 세포의 부착력을 현저히 감소시켰으며, 세포 표면에 α2β1 integrin의 발현을 감소시켰다. 게다가 누룩치와 BS-Ⅳ는 caspases를 활성화시켜 생존에 중요한 신호를 보내는 FAK, Akt, ERK, JNK을 통한 세포신호전달을 억제함으로서 세포생존을 억제하는 한편 세포사멸을 유도한다는 것을 확인 할 수 있었다.암전이 동물모델에서 생쥐 대장암세포인 CT-26 세포로 유도된 폐로의 암 전이를 누룩치와 BS-Ⅳ가 억제하는 것을 확인하였다.이러한 결과로부터 누룩치 추출물과 BS-Ⅳ가 대장암 세포의 세포사멸을 유도하고 암전이를 억제함으로써 화학적 암 예방제로의 개발가능성을 확인하였다.

[영문]Colorectal cancer remains one of the most frequent malignant neoplasms worldwide. Epidemiological studies of colorectal cancer incidence suggest that the development of these diseases can be modulated by dietary factors. In the present study, to access the chemopreventive activity, we investigated the proapoptotic effect of Pleurospermum kamtschaticum (Pl-K) and buddlejasaponin Ⅳ (BS-Ⅳ), one of active components of the aerial part of Pl-K, and their mechanism of action in human colon cancer HT-29 cells. We also to investigate whether Pl-K and BS-Ⅳ inhibit the formation of tumor nodules in the lung metastasis induced by murine colon cancer CT-26 cells in BALB/c mice. Pl-K and BS-Ⅳ significantly reduced the viability of HT-29 cells, displaying a characteristic ladder pattern of DNA fragmentation, chromatin condensation and redistribution of membrane phosphatidylserine. Pl-K and BS-Ⅳ increased the ratio of Bax to Bcl-2, the activation of caspase-9 and caspase-3 and subsequent cleavage of PARP. Cell attachment to the extracellular matrix via integrin may play a key role in cellular processes such as proliferation, growth and survival. Thereby loss of cell attachment to the ECM causes apoptosis. To further elucidate the molecular mechanism underlying the apoptosis-inducing capability of Pl-K and BS-Ⅳ, their effects on cell adhesion and integrin-mediated signaling were explored. Pl-K and BS-Ⅳ decreased the attachment of HT-29 cells to extracellular matrix proteins, collagen type I, Ⅳ and laminin, and downregulated α2β1 integrin surface expression. Pl-K and BS-Ⅳ treatment inhibited both expression and phosphorylation of FAK, Akt, ERK and JNK as well as they reduced the phosphorylation of Src. The reduction of total expression of FAK, Akt, ERK and JNK was suppressed by caspase inhibitor, not proteasome and calpain inhibitor. Moreover, the mRNA expression levels of FAK, Akt, ERK and JNK was reduced by Pl-K and BS-Ⅳ. Taken together, Pl-K and BS-Ⅳ induced apoptosis via mitochondrial dependent pathway by increasing the ratio of Bax to Bcl-2 and subsequent activation of caspases. In addition, Pl-K and BS-Ⅳ inhibited cell survival by lowering the activation of integrin-mediated signaling molecules through the reduction of α2β1 integrin expression and the degradation by caspase. Furthermore, we showed that Pl-K (5 mg/kg, body weight /day 62.1 % reduction) and BS-Ⅳ (2 mg/kg, body weight /day 52.9 % reduction) inhibited the formation of tumor nodules in the lung metastasis induced by murine colon cancer CT-26 cells in Balb/C mice. These results demonstrated that Pl-K and BS-Ⅳ exert the potent chemopreventive effect.