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백서 C6 뇌교종세포주에서 dexamethasone에 의한 camptothecin 유도 세포고사 억제 기전

Other Titles
 Mechanism of inhibition of camptothecin-induced apoptosis by dexamethasone in C6 glioma cells 
Authors
 조재호 
Issue Date
2006
Description
의학과/박사
Abstract
[한글]중추신경계 종양의 50%를 차지하며 성인에서 가장 호발하는 악성교종은 수술, 항암제 및 방사선치료의 다병합요법에도 높은 재발률로 매우 불량한 예후를 보인다. 이는 종양 세포 자체 및 외적인 요소 등의 다양한 내성 기전에 의한 것으로 이들 내성 기전에 대한 연구는 질병의 완치율을 높이기 위해 필수적이다. 최근 뇌교종세포에서 dexamethasone이 camptothecin의 세포고사(apoptosis) 유도 효과를 감소시키며, 동시에 세포생존신호인 Bcl-xL 상승을 동반함이 밝혀졌다. 임상에서 뇌종양 환자에서 부종을 감소시키기 위해 늘 쓰이고 있는 스테로이드가 세포내 anti-apoptotic signal인 Bcl-xL 발현을 증가시키는 것은 항암제나 방사선과 같이 세포고사를 유도하는 치료법의 암세포 사멸효과를 저하시키는 역할을 할 수 있다는 점에서 중요한 의미를 가진다고 할 수 있다. 따라서 본 논문은 뇌교종 세포에서 스테로이드 투여 후 Bcl-xL 발현 증가를 위한 세포내 신호전달 과정상 상위전사조절물질들에 대한 연구를 통해 dexamethasone에 의해 camptothecin 유도 세포고사가 억제되는 전체적인 신호전달 기전을 규명하고자 하였다.뇌교종세포주인 백서 C6 교종세포를 대상으로 실험을 진행하였으며, 세포고사 유도를 위해 camptothecin 2 μM을 배지에 첨가하였다. Camptothecin에 의해 유도되는 세포고사의 확인 및 정량적 분석을 위해서 caspase-3 특이 활성도를 측정하는 CaspACETM?(Promega, Madison, USA) system 과 DNA 분절 정도를 확인하는 Cell Death Detection ELISA Plus Kit?(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하였다. Camptothecin에 의해 증가되었던 caspase-3 특이 활성도 및 DNA 분절 현상은 dexamethasone 전처치로 크게 감소하였다. Dexamethasone 투여 후 Bcl-xL의 시간대별 증가 양상을 재확인 하였으며, 세포고사 억제 효과도 이러한 Bcl-xL 발현의 시간에 따른 변화에 상응하는 양상이었다. Dexamethasone에 의한 세포고사의 유도 및 Bcl-xL의 상승은 glucocorticoid receptor antagonist인 RU486(Mifepristone)에 의해 역전되어, 이 기전의 초기 단계에 glucocorticoid receptor (GR)가 관여함을 알 수 있었다. 일부 보고에서 STAT5가 Bcl-xL 유전자의 주된 조절자 중의 하나로 밝히고 있으며, 본 실험에서 사용된 뇌교종세포에서 dexamethasone에 의한 Bcl-xL 상승에 STAT5가 상위조절인자로 역할을 하는지를 보기 위한 실험을 진행하였다. Dexamethasone 투여 후 인산화로 활성화된 STAT5 단백질은 그 발현이 증가하였으며, electrophoretic mobility shift assay (EMSA)상 dexamethasone의 투여는 STAT5의 DNA 결합능도 증가시켰다. 또한 STAT5 단백질을 dominant negative 형태로 발현 가능한 재조합 아데노바이러스인 AdStat5aΔ740을 뇌교종 세포주인 C6에 감염시킨 후 세포내에서 Bcl-xL 단백질의 발현양이 확연히 감소됨을 확인하였다. 따라서 뇌교종세포주인 C6에 dexamethasone의 처리로 인하여 증가되는 Bcl-xL 단백질의 발현에 있어 STAT5 단백질이 전사 수준에서 직접적으로 관여하고 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 또한 dexamethasone 처리 후 뇌교종세포주에서 STAT5와 GR 사이에 어떤 형태의 관련성이 있는지를 보고자 시행된 co-immunoprecipitation상 dexmethasone 투여 후 초기 2시간 이내에 STAT5와 GR의 물리적 결합이 이루어짐을 확인할 수 있었다.결론적으로 C6 뇌교종세포주에서 dexamethasone이 투여되면 이는 GR에 ligand 로서 결합을 하게 되고, GR은 STAT5의 활성을 유도하고, 이와 물리적 결합을 하게 된다. 이 두 단백질 복합체는 핵 내로 이동하여 Bcl-xL의 프로모터의 STAT5 단백질이 결합할 수 있는 DNA 영역에 붙어서 전사를 조절하게 된다. STAT5의 하위신호전달 물질인 Bcl-xL 단백질이 전사조절단계에서 조절되어 그 양이 증가되고, 결국 이는 camptothecin에 의해 유도되는 세포고사를 억제하는 것으로 생각된다.따라서 임상에서 뇌종양 환자에서 흔히 쓰이고 있는 스테로이드 투여는 각종 항암제에 대해 세포사멸효과를 떨어뜨릴 수 있으므로 향후 이 기전 연구를 바탕으로 dexamethasone에 의해 생길 수 있는 가능한 내성요인을 극소화하는 방법을 모색해야 할 것이다.

[영문]Malignant glioma, which is the most common primary central nervous system tumor in adults, carries extremely poor prognosis despite aggressive treatment with surgery, irradiation, and/or chemotherapy. These tumor cells are notoriously resistant to apoptosis. Resistance to apoptosis can be achieved via the up-regulation and/or down-regulation of anti-apoptotic or pro-apoptotic Bcl-2 family members, respectively. Recently dexamethasone, a synthetic glucocorticoid, is reported to induce partial resistance to anticancer drugs in glioma cells by transcriptional activation of Bcl-xL gene. The notion that the steroid, used commonly to relieve edema associated with brain tumor, protects cells from camptothecin, directed this study to investigate the upstream regulators for Bcl-xL transactivation after dexamethasone treatment.For the induction of apoptosis in C6 glioma cells, 2 μM of camptothecin was added to the culture medium. Apoptotic cell death was confirmed by a colorimetric caspase-3 assay with CaspACETM?(Promega, Madison, USA), and DNA breakage by Cell Death Detection Elisa Kit?(Roche, Mannheim, Germany). Increased caspase-3 activity and DNA fragmentaion after camptothecin alone was markedly reduced in cells pre-treated with 1 μM of dexamethasone. This effect was abolished by glucocorticoid receptor (GR) antagonist RU486, indicating that the protection due to dexamethasone is mediated via this receptor. Bcl-xL, which is markedly up-regulated in a time-dependent fashion following exposure to dexamethasone. The extent of apoptosis inhibition by dexamethasone corresponded well with the change of Bcl-xL expression according to exposure time to dexamethasone. In order to study the role of STAT5 in this signaling cascade, we determined Bcl-xL expression with introduction of dominant-negative STAT5. C6 glioma cells infected with the dominant negative STAT5 adenovirus, AdStat5aΔ740, suppressed strongly expression of Bcl-xL gene, indicating that Bcl-xL expression was controlled in transcriptional level by STAT5. Upon dexamethasone treatment, phosphorylated STAT5 increased within 2 hour and gradually decreased from 4-6 hour on western blot. On electrophoretic mobility shift assay (EMSA) to investigate nuclear DNA binding activity of STAT5 protein, the binding activity increased gradually up to 4 hour and then decreased thereafter. Nuclear extract was immunoprecipitated with a GR receptor specific antiserum, and developed on immunoblot with a STAT5 specific antiserum. Untreated control cells showed minimal activity of phosphorylated STAT5, whereas cells treated with dexamethasone for 2-4 hour had increased phosphorylated STAT5 activity. In summary, dexamethasone binds to GR, which then activates STAT5. Activated GR complexes with STAT5, and helps it to direct the STAT5 DNA binding site, providing positive enhancement of STAT5 transactivation for Bcl-xL regulation. Ultimately this mechanism study will have a role to identify therapeutic drugs or methods to reverse the effect of inhibition of camptothecin-induced apoptosis by dexamethasone which is needed essentially in the treatment with brain tumor.
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1. College of Medicine (의과대학) > Dept. of Radiation Oncology (방사선종양학교실) > 3. Dissertation
Yonsei Authors
Cho, Jae Ho(조재호) ORCID logo https://orcid.org/0000-0001-9966-5157
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/123016
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