퇴행된 인간 추간판 세포에서 파미드로네이트의 생물학적 효과

Abstract

[한글]목적 : 척추 추간판 세포에 2세대 비스포스포네이트 제제인 파미드로네이트를 투여하고, 세포 증식, 기질 합성 반응을 알아보고 역시 추간판 세포배양에서 세포 생존성을 떨어뜨린 후 파미드로네이트를 투여하여 세포 생존성, 기질 분해 효소 발현 등을 알아보고자 하였다.대상 및 방법 : 추간판 조직은 추간판 술식을 시행한 10명의 환자로부터 채취하였고 채취된 추간판 조직은 순차적 효소 소화법으로 세포를 분리하였다. 추간판 세포에 TNF-alpha를 이용하여 세포의 생존성을 떨어뜨렸다. 추간판 세포 배양에 파미드로네이트 0, 10-12, 10-10, 10-8, 10-6 M의 농도로 각각 첨가하여 24시간과 48시간동안 배양하였다. 각 배양군에서 당단백 생성, 세포 증식 반응, 세포 생존성 반응 및 matrix metalloproteinase (MMP)-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9과 MMP-13의 mRNA 발현, MMP-1, MMP-13의 단백질 발현량을 측정하였다.파미드로네이트를 처리하지 않고 DMEM/F12 (10% FBS, 1% v/v penicillin/streptomycin, 25 ㎍/ml ascorbate)으로만 배양한 추간판 세포 배양을 양성 대조군으로 삼았으며, DMEM/F12 (1% FBS, 1% v/v penicillin/streptomycin, 25 ㎍/ml ascorbate)으로 배양한 추간판 세포 배양을 음성 대조군으로 삼았다.결과 : 파미드로네이트를 추간판 세포에 농도별로 처리한 결과 대조군과 비교하여 세포 증식의 의미 있는 변화는 관찰되지 않았으나, DNA 증식으로 정상화한 당단백의 합성은 대조군과 비교하여 저농도인 10-9 M 의 파미드로네이트 투여군에서 20.1 % (p<0.05) 증가했다.추간판 세포에 10-12 ~ 10-6 M의 파미드로네이트를 처리한 결과 세포사멸에 대해 보호 효과를 관찰 할 수 있었다. Hemocytometer를 이용하여 세포의 생존성 반응을 24 시간과 48 시간 동안 분석한 결과 양성 대조군 (10% FBS)에 비해 음성대조군 (1% FBS)에서 각각 24.4 %와 30.1 %의 생존능이 떨어졌고, 음성 대조군 (1% FBS)에 비해 TNF-alpha로 세포 생존능력을 떨어뜨린 세포에서는 각각 6.9 %와 30 %의 생존능이 떨어졌다.추간판 세포에서 TNF-alpha (10 ng/ml)로 24시간 동안 세포 생존능력을 떨어뜨린 후, 10-12, 10-10, 10-8, 10-6 M의 파미드로네이트를 처리한 결과 파미드로네이트를 처리하지 않은 음성대조군에 비해 각각 23.5 %, 11.3 %, 26.4 %, 9.9 % (p<0.05)의 생존성이 증가했고, 세포 생존 능력을 48 시간 동안 떨어뜨린 결과 음성대조군에 비해 각각7 %, 15.5 %, 19.6 %, 7.8 % (p<0.05)의 생존성이 증가했음을 알 수 있었다.RT-PCR 후 densitometry를 시행한 결과, 대조군과 비교했을 때 실험군에서 제I형 교원질, 제II형 교원질, 그리고 aggrecan의 mRNA 발현이 차이는 없었다. 1% FBS와 TNF-alpha로 세포 생존능력을 떨어뜨린 추간판 세포에서 MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13 mRNA의 발현과 MMP-1의 단백질 발현량은 증가하였으나, 파미드로네이트를 처리했을 경우, MMPs mRNA의 발현에 의의 있는 변화는 없었으나, MMP-1과 MMP-13 단백질의 발현량은 감소했다.결론 : 척추 추간판 세포에서 파미드로네이트는 기질 생성 자극, 연골성 표현형 유지, 세포 생존성에 자극 등의 효과를 나타내어 추간판 변성의 치료적 수단으로 이용될 수 있을 것이다.

[영문]

As potent inhibitors of bone resorption, bisphosphonates(BPs) are widely used for the treatment of bone disorders because of increased osteoclast activity. BPs are also broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitors which involves cation chelation. Apoptosis appears to provide an important mechanism that contributes to the death of disc cells and thus disc degeneration. In articular chondrocytes, BPs appear to prevent dexamethasone induced growth retardation and apoptosis. Accordingly, the objective of this study is to investigate the effect of pamidronate, N-containing BP, on human intervertebral disc cells in terms of cellular proliferation, matrix synthesis, mRNA expression of matrix components, apoptosis, and mRNA expression of MMP.Human disc tissues were obtained from three patients with degenerative disc disease. Intervertebral disc cells were isolated by sequential enzymatic method. Apoptosis was induced by using TNF-alpha. Each culture was allocated to 1) positive control cultures with 10% FBS; 2) negative control cultures with 1 % FBS; 3) experimental cultures in 1 % FBS with TNF-alpha (10 ng/ml); 4) experimental cultures in 1 % FBS and TNF-alpha (10 ng/ml) with a various dose of pamidronate (10-12, 10-10, 10-9, 10-8, 10-6 M). [3H]-Thymidine for DNA synthesis and [35S]-Sulfate incorporation for proteoglycan synthesis were performed. The cells were counted on a hemocytometer using trypan-blue exclusion to assess cellular viability. Reverse transcription polymerase chain reaction for mRNA of beta-actin, collagen type I, collagen type II, aggrecan, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, and MMP-13 was performed.Disc cell cultures with various concentrations of pamidronate (10-12, 10-9, 10-6M) showed no significant increase in DNA synthesis compared to control culture. However disc cell cultures with pamidronate showed significant increase in proteoglycan synthesis, 20.1% increase with 10-9 M pamidronate (p<0.05), compared to control culture. Disc cells with various dose of pamidronate showed similar patterns of mRNA expression of collagen type I, II, aggrecan compared to culture without pamidronate. In serum starved condition (1% FBS) with TNF-alpha(10ng/ml), pamidronate with concentration of 10-12 to 10-6 M demonstrated a stimulation effect of cell viability. Cultures with 1 % FBS showed upregulation of MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13 mRNA expression and MMP-1 protein expression, while cultures with given dose of pamidronate showed no change in the expression of MMPs mRNA. However, cultures with given dose of pamidronate showed down-regulation of MMP-1 and MMP-13 protein expression.Pamidronate, N-containing BP has anabolic and anti-resorptive effect and stimulation of cell viability on intervertebral disc cells and their matrix.