부분적으로 절편된 조직의 RNA를 이용한 위장관 암의 유전자 발현 양상

Abstract

[한글]

cDNA microarray 기법은 암 연구 분야에서 여러 종류의 종양을 진단하는데 있어서 생물학적 표지자를 동정하거나 항암치료의 효과를 예측하는데 널리 적용되고 있다. 하지만 유용하게 사용되고 있는 cDNA microarray의 경우 많은 양의 RNA나 양질의 RNA를 필요로 하는 제한점을 가지고 있다. RNA amplification은 RNA의 양의 제한점을 극복하기 위해 고안되었으며, 현 시점에서 실험에 사용될 수 없어 절편된 RNA를 이용할 수 있는 방법이 필요로 되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 절편된 RNA를 이용한 cDNA microarray 실험의 가능성과 그 유용성을 알아보고자 하였다.YCC-16 위암 세포주의 양질의 RNA에 RNase와 NaOH를 처리하여 절편된 RNA를 만들어 RNA 증폭이 가능함을 확인하였고, 7.5K cDNA microarray를 이용하여 RNA 증폭을 기반으로 한 cDNA microarray를 수행하여 분석 가능한 결과를 얻을 수 있었다. 양질의 RNA와 절편된 RNA를 비교하기 위하여 상관계수와 discordance를 구하여 비교한 결과, 양질의 RNA와 절편된 RNA를 이용한 실험의 결과가 유사함을 확인하였다.실제 임상시료 중 절편된 대장암과 위암의 정상 및 종양조직을 각각 10 예씩을 가지고 17K cDNA microarray를 이용하여 RNA 증폭을 기반으로 한 cDNA microarray를 수행하였다. 그 결과 소량의 ribosomal peak이 남아있을 정도로 절편된 경우 microarray 실험을 통하여 유전자 발현 양상을 관찰할 수 있음을 확인하였고, unsupervised clustering을 통해서 절편된 RNA로도 위 조직과 대장 조직 및 정상과 종양조직이 구분되는 것을 관찰하였다.조직을 이용한 microarray 실험에서 절편된 RNA와 양질의 RNA를 비교하고자 대장암과 위암에서 정상과 종양조직, 각각 절편된 RNA 10 예, 양질의 RNA 10 예씩의 microarray 결과를 비교하였다. Unsupervised clustering 결과, 양질의 RNA와 절편된 RNA의 유전자 발현 양상이 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 양질의 RNA에서 정상과 종양조직간의 유의한 유전자로 선정된 169 개 (FDR 0.39%)의 유전자와 절편된 RNA에서 선정된 114 개 (FDR 0.36%)의 유전자 중 12 개의 유전자 만이 겹침으로서, 양질의 RNA와 절편된 RNA의 발현 양상이 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었다.RNA의 절편된 정도가 유전자 발현 양상이 달라지는 데에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 대장의 절편된 RNA를 깨진 정도에 따라 세 그룹으로 나누어 각 그룹에서 정상과 종양조직간에 유의한 유전자를 선정하였다. 선정된 유전자 군을 비교하였을 때 (A, B, C 각 84, 98, 98 개), 절편 정도가 심하지 않은 A 그룹에서 선별된 유전자 군과 절편 정도가 심한 B나 C그룹에서 선별된 유전자 군은 전혀 일치하지 않았다. 양질의 RNA에서 정상과 종양조직 간에 유의한 것으로 선정된 유전자 (FDR 1 % 142 개)와 비교한 결과, A그룹에서 선정된 유전자 중 38개가 일치하였고, B나 C그룹에서 선정된 유전자와는 일치하지 않음을 관찰하여, RNA의 절편된 정도가 결과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.한편 대장암에서 절편된 RNA에서 정상과 종양조직 간에 유의한 유전자로 선정된 유전자 군을 이용하여 양질의 RNA microarray data로 clustering을 시행한 결과 정상과 종양조직이 구분되는 것을 확인하였다. 또한 이는 양질의 RNA에서 선정된 유전자를 가지고 절편된 RNA 결과를 이용하였을 때도 같은 결과를 얻을 수 있었다. 즉, 절편된 RNA를 이용하였을 경우 양질의 RNA를 이용한 실험에서와는 다른 종양 관련 유전자 군이 선정되나, 그 유전자 군도 생물학적으로 유용함을 제시하고 있다.본 연구의 결과를 통하여 부분적으로 절편된 RNA를 이용하여 유전자 발현 양상의 관찰이 가능하다는 것은 보여주었고, 적절한 생물학적 의미를 위해서는 좀 더 주의 깊은 분석과 검증이 필요할 것으로 생각된다.

[영문]Recently, cDNA microarrys are widely applied in cancer research to identify the candidate biomarkers for prognosis of various cancers or predicting the efficacy of cancer therapy. Besides the limitation of RNA amount in cDNA microarray, the other significant limitation is the requirement of good quality of RNA. Various RNA amplification methods have been devised to overcome limitation of amounts and there had been strong demands to use even the partially degraded RNAs for gene expression analysis.The purposes of this study are to evaluate the possibility of using degraded tissue RNAs for gene expression analysis and to evaluate the reliability of the microarray data from the degraded RNA.Intact RNA from YCC-16 gastric cancer cell and their degraded products were prepared by RNase A or NaOH treatment. T7 linear RNA amplification-based cDNA microarray with intact and degraded RNA using 7.5K human cDNA microarray in an indirect design was performed. The degraded RNA was successfully amplified and the quality of microarray data was acceptable for gene expression profiling. To evaluate the similarity between intact and degraded RNA a Pearson correlation coefficient (r2) and discordance rates were analyzed. The correlation coefficients between 3 conditions were 0.93 between I-RNA and Rd-RNA and 0.86 between I-RNA and Nd-RNA. The quantity discordance rate was decreased at the larger fold-changes.Next, T7 linear RNA amplification-based cDNA microarray with partially degraded colon and gastric tissue RNAs (10 normal & 10 tumor tissues for each tumor type) using 17K human cDNA microarray in an indirect design were performed. After the preprocessing, the gene expression profiling was compared with previous microarray data of intact tissue RNAs (10 normal & 10 tumor tissues for each tumor type) using unsupervised clustering and the differentially expressed genes between normal and cancer tissues using SAM.The degraded tissue RNAs with at least one ribosomal peak could be successfully amplified and resulted in reliable gene expression profiling. However, the gene expression patterns of intact and degraded RNAs were different both in clustering and selected genes. Among the selected colon cancer specific genes, 114 (FDR 0.36%) in intact and 169 (FDR 0.39%) in degraded tissues, only 12 genes between them were overlapped, and the functional category of selected genes in each condition was not exactly identical.In order to evaluate the influence of degraded states, a partially degraded colon tissue RNAs were divided into three groups. As the selected significant genes from intact RNA data tend to more similar to A group of mild degraded RNA than B, C group of moderate to severely degraded RNA, it is suggested that the degree of RNA degradation might affect the expression profiling.Although the selected genes differ with in intact RNA and degraded RNA, to observe the reliability of selected significant genes in degraded RNA microarray data, results of clustering using the selected significant genes in degraded RNA to intact microarray data set showed could classify normal and tumor, and vise versa.In summary, the gene expression profiling is possible using partially degraded tissue RNAs, but the cautious data analysis for relevant biological meaning is needed.