구강점막 각화상피세포의 피부 재상피화 유도

Abstract

[한글]

서론: 배양 세포를 이용하여 조직의 기능적 재생을 얻으려면, 적절한 세포의 선택과 충분한 배양 기간을 거쳐 재건된 조직을 결손부위로 이동시킬 운반체가 필요한데, 자가 구강점막 각화상피세포를 배양하여 부유 형태로 이식하는 방법은 배양에 필요한 시간을 줄이고, 특별한 운반체 없이 간편하게 임상에 적용할 수 있는 장점이 있다.본 연구의 목적은 일차 배양하여 부유시킨 구강점막 각화상피세포의 창상 치유의 기전에 대한 in vivo 연구를 통해, 배양하여 이식된 세포가 창상 결손부에서 생착하여 치유가 이루어지는 것인지, 아니면 이식된 세포에 의해 정상 상피세포가 수혜부의 가장자리로부터 이주하도록 유도(induction)되는 것인지를 규명하고, 또한 배양세포의 이식을 통한 창상 치유 과정에서 싸이토카인과의 연관성을 알아보고자 하였다.연구 방법: 실험 동물로는 8주된 20±2g의 암컷 누드마우스를 사용하였다. 구강점막 각화상피세포 이식의 실험에는 이식을 시행하지 않은 대조군과 구강점막 각화상피세포를 이식한 이식군에 각각 15마리가 사용되었고, recombinant human IL-1α(rh IL-1α) 처리 실험에는 5일 대조군과 5일 rh IL-1α 실험군에 각각 3마리가 사용되었다. 구강점막 각화상피세포는 건강한 성인의 제 3 대구치 발치 시 염증이 없는 부위의 치은을 채취하여 일차 배양하였다. 세포 생존능 분석과 세포 주기 분석을 통해 BrdU의 표지 간격을 정하고 이식 전에 배지에 첨가하여 구강점막 각화상피세포에 BrdU를 표지하였다. 누드마우스의 등에 1.5㎝×1.5㎝ 크기의 피부 전층 결손부를 형성한 후 수축 방지를 위해 봉합하여 고정하였다. 배양 세포는 1×106cells/40㎕가 되게 부유하여 이식하였다. 각각의 군은 술 후 3일, 1주, 2주째에 희생시켜 결손부위에 대한 조직 생검을 실시하였다. 광학 현미경 하에서 조직학적 변화를 관찰하고 영상분석기를 이용하여 재생된 상피층의 길이를 조사하였다. 이식군에 대해서는 anti-BrdU와 anti-cytokeratin(CK) AE1/3를 이용하여 이중 면역조직화학적 평가를 시행하였다. 3일, 1주, 2주의 이식군과 대조군의 생검된 조직으로 keratinocyte growth factor(KGF), interleukin-6(IL-6), interleukin 1α(IL-1α)에 대해서 western blot 분석을 시행하였고, 싸이토카인의 효과를 검증하기 위해서 구강점막 각화상피세포 대신 rh IL-1α를 처리하여 조직학적 관찰 및 재생된 상피층의 길이를 측정하고 대조군과 비교하였다.결과: 1. 조직학적 소견 및 영상분석기를 이용한 재생된 상피층의 길이를 측정한 결과, 대조군보다 이식군에서 통계적으로 유의한 빠른 재상피화를 보였다 (p<0.05). 이식군은 2주째에 창상부위의 완전한 재생을 보였으며 재생된 조직은 정상 피부 조직과 유사한 소견을 보였다.2. 이식군에 대한 이중 면역조직화학 검사 결과, anti-BrdU에 양성인 세포는 3일 이식군에서 창상변연부의 이행부위에는 존재하지 않고 창상변연부와 동떨어진 중심부에서 관찰되었고, 1주 및 2주 이식군에서는 관찰되지 않았다.3. Western blot 분석 결과, 이식군은 대조군에 비해 KGF, IL-6, IL-1α의 발현이 증가되었고, 시기적으로 각각 다른 단계에서 발현을 보였다.4. rh IL-1α 실험군은 대조군에 비해 빠른 재상피화를 보였다.결론: 이러한 결과로 배양된 구강점막 각화상피세포의 이식에 의한 피부 재상피화의 증진은 이식된 세포의 생착에 의한 것이 아니라, 이식된 세포에 의해 정상 상피세포가 수혜부의 가장자리로부터 이주하도록 유도(induction)되는 것이며, 이러한 창상 치유의 촉진에는 배양된 각화상피세포와 수혜부 결합조직에서 분비되는 것으로 추정되는 싸이토카인이 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

[영문]The aim of this study was to investigate the wound healing effect of primary cultured oral mucosal keratinocytes and to assess their roles in skin wounds. Primary cultured and suspended oral mucosal keratinocytes, labeled with BromodeoxyUridine(BrdU), were scattered onto 1.5㎝×1.5㎝ sized full thickness skin defects of the adult female nude mice in the graft group(N=15), and no grafts were placed in the control group(N=15). They were sacrificed at 3 days, 1 week and 2 weeks after treatment. Histological examination of each wound was performed to review the healing progress by measuring the length from the wound margin to the regenerating epithelial front. The fate of keratinocytes was assessed by double immunohistochemical staining with anti-BrdU and anti-cytokeratin AE1/3 in the graft groups. The wound was completely covered with regenerating epithelia in 2 weeks in the graft group, but was partially covered with regenerating epithelia in the control group. The immunohistochemical studies revealed that most of regenerating epithelial cells was induced from marginal epithelium of the margin, not from the scattered keratinocytes. Expression of interleukin-1α(IL-1α), interleukin-6(IL-6), keratinocyte growth factor(KGF) were determined for both graft and control groups by western blot analysis respectively, which demonstrated that oral mucosal keratinocyte underwent a staged response to wounding by production of pro-inflammatory cytokines(IL-1α, IL-6) and growth factors(KGF). To verify the effect of the cytokine, human recombinant IL-1α(rh IL-1α) was treated instead of oral mucosal keratinocyte transplantation. The IL-1α treatment group showed faster re-epithelialization than control groups. We could successfully confirm that the graft of primary cultured oral mucosal keratinocytes promotes the regeneration of skin defects. The mechanism of wound healing by primary cultured oral mucosal keratinocytes is considered to be induced by the acceleration of cytokine expression required for re-epithelialization.