임상분리 결핵 균주간의 유전적 다형성

Abstract

[한글]

결핵은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 발생하는 만성 세균감염증으로 세계보건기구 (World Health Organization; WHO)에서 ''global emergency’로 선포하였을 만큼 세계적인 보건 문제이다. M. tuberculosis complex에 속하는 균주들은 전체 뉴클레오타이드 서열이 99.9%의 유사성을 보이고 있음에도 불구하고 숙주특이성과 발병력에서 많은 차이를 보이고 있다. 최근 환자에서 분리된 결핵균 임상분리 균주들에서 균주에 따라 병원성과 관련된 표현형들이 차이가 있음이 밝혀지고 있는데 이와 같은 발병력의 차이를 설명할 수 있는 분자유전학적인 연구는 아직 충분하지 않다.본 연구는 결핵균 임상분리 균주들에서 보이는 발병력의 차이가 각 균주들이 가지고 있는 유전 정보의 차이에 기인할 것이라는 가정에 따라 몇 가지 임상분리 균주들의 유전적 다형성을 분석하였다. 이를 위하여 최근에 밝혀진 임상분리 결핵균 K 균주의 유전체 염기서열을 결핵균 표준균주 H37Rv의 염기서열과 비교분석하여 이 균주들 사이에 차이 (결손 혹은 삽입)를 보이는 염기서열들을 연구대상으로 선정하였고 국내 및 국외에서 분리된 임상분리 균주들을 대상으로 해당 DNA 절편을 PCR로 증폭하고 염기서열을 결정하여 각 부위의 유전적 다형성을 규명하였다.K 균주와 H37Rv 균주의 전체 염기서열을 비교하여 K 균주에서 153 개의 결손과 124 개의 삽입이 일어났음을 확인하였다. 결손과 삽입에 의해서 각 96개와 51개의 open reading frame (ORF)이 영향을 받았으며 이들 대부분은 PE, PPE family, hypothetical protein, transposase을 coding하고 있었다. 각 부위에서 균주간의 다형성을 확인하기 위해 54 부위의 결손과 58 부위의 삽입을 대상으로 40개의 임상분리 균주에서 PCR을 수행하였다. 임상분리 균주 A, a, b, d, 13, 18은 전반적으로 H37Rv와 유사한 삽입 및 결손을 보이는 반면 나머지 임상분리 균주들은 각 부위에 따라서 다양한 크기의 결손과 삽입을 가지고 있음을 확인하였다. Del_3, Del_16, Del_18 부위는 K 균주에서만 결손되었고, Del_29, Del_36은 모든 K family에 속하는 균주들에서 결손된 것으로 확인되었다. 따라서 이들 부위에 위치하고 있는 유전자들이 K 균주에 특이적인 발병력에 기여할 것으로 예상된다. 결손과 삽입 중에서 21 부위를 선정하여 염기서열을 결정하여 분석한 결과 PCR 산물의 크기가 같을 경우 염기서열이 동일하였고 PCR 산물의 크기가 다를 경우에 결손이나 삽입에 의하여 염기서열의 변화가 있었으며, 이로 인하여 아미노산 서열에도 변화가 있음을 확인하였다.지금까지의 비교유전체 연구는 DNA microarray를 기반으로 하여 수행되었기 때문에 이미 알려져 있는 염기서열에서 결손된 유전자들을 탐색하는 것에는 유용하지만 근본적으로 새롭게 삽입된 유전자들에 대한 정보를 제공할 수는 없다. PCR 및 sequencing을 이용하는 본 연구는 결손이 일어난 염기서열에 대한 정보 뿐 아니라 삽입된 염기서열의 탐색도 가능하기 때문에 기존의 연구결과보다 광범위한 결과를 축적할 수 있었다. 이러한 결과는 각 임상분리 균주에서 발견되는 발병력의 차이에 대한 유전적인 원인을 규명할 수 있는 기초 정보들을 제공함으로써 결핵균의 발병인자를 탐색하고 병인기전을 규명하는데 기반이 될 수 있을 것이다.

[영문]Despite the efforts to combat tuberculosis it still remains one of the major public health problems, which forced World Health Organization (WHO) to declare tuberculosis a global emergency in 1993. Mycobacterial species belonging to Mycobacterium tuberculosis complex show 99.9% similarity in nucleotide sequences, but they differ widely in their host tropisms and phenotypes related to pathogenicity. Recently clinical strains of M. tuberculosis showing diversity in virulence phenotype have been reported, but the molecular basis for the phenotypic diversity among the clinical isolates remains poorly understood.Based on the assumption that genetic differences among clinical strains account for the phenotypic variation, genetic polymorphism among recent clinical isolates of M. tuberculosis was investigated. Comparison of the whole genome sequence of M. tuberculosis K strain, one of the most prevalent strains in Korea, with that of M. tuberculosis H37Rv revealed the presence of 153 deletions and 124 insertions in the K genome relative to the H37Rv genome. Those deletions and insertions affect 96 ORFs and 58 ORFs, respectively, which encode mostly PE, PPE family proteins, hypothetical proteins and transposases. DNA fragments corresponding 54 deletions and 58 insertions were amplified by PCR with specific primers and analyzed to find genetic variations among 40 clinical isolates.Clinical isolate A, a, b, d, 13 and 18 showed similar insertions and deletions found in H37Rv, while other isolates showed variations similar to K strain. Del_3, Del_16 and Del_18 were found to be unique in K strain and Del_29 and Del_36 were shown to be conserved among members of K family, suggesting that variations in these loci may account for the hypervirulence of K strain. Nucleotide sequences of PCR products carrying 21 selected deletions and insertions showed that PCR products with the same size have identical nucleotide sequence for each deletion or insertion, while PCR products with variations in size have altered nucleotide sequences because of insertions or deletions, which result in changes in amino acid sequences.In this study PCR amplification of targeted regions and sequence analysis have provided information on both insertions and deletions, in contrast to the conventional comparative genomic approaches based on DNA hybridization which identify deletions only. The information presented herein could contribute to the identification of M. tuberculosis genes associated with virulence of the pathogen.