Pharmacogenomic markers predicting toxicity and response of gemcitabine in breast cancer patients

Abstract

[한글]

Gemcitabine의 대사 과정에 관여하는 유전자의 단일염기다형성 (SNP: Single Nucleotide Polymorphism)을 통하여 유방암 환자들의 약제에 대한 부작용과 치료 효과를 예측할 수 있는 예측 인자를 선별하고자 하였다. 약제의 대사에 관여하는 deoxycytidine kinase (dCK), deoxycytidine monophosphate deaminase (DCTD), 그리고 약제의 대상인 ribonucleotide reductase M1 polypeptide (RRM1) 의 3 가지 유전자를 선정하였다. Gemcitabine을 투여한 76 명의 진행성 유방암 환자들과 정상인 56명의 말초혈액, 그리고 10 개의 유방암 세포주로부터 추출한 genomic DNA를 이용하여 단일염기다형성을 분석하였다. 유방암 환자들의 각 유전자들의 SNP 빈도수는 1.4% (626 A>G), DCTD 10.8% (315 T>C), 1ST RRM1 40.5% (2455 A>G), 2ND RRM1 44.6% (2464 G>A), 그리고 RRM1의 2 부위 동시에 존재하는 경우가 23%로 나타났다. 이러한 결과는 정상군에서도 비슷한 결과를 나타내었다. 본 연구에서 확인한 RRM1의 2 부위 동시에 SNP가 존재하는 것(2455 A>G, 2464 G>A)은 알려져 있지 않는 결과였다. RRM1의 2 부위 동시에 SNP가 존재하는 경우를 토대로 하여 toxicity 지표인 neutropenia (p < 0.01), G-CSF requirement (p < 0.005) 비교 분석해 본 결과 높은 상관관계를 가지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 RRM1의 3가지 genotype을 이용하여 Hardy-Weinberg equation을 통해 haplotype을 구해 본 결과 앞선 genotype과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 세포주를 이용한 in vitro 연구를 통해 SNP를 가지는 RRM1의 gemcitabine 약제 감수성과의 상관관계를 살펴보았다. 먼저 10 개의 유방암 세포주들의 약제에 대한 세포 독성 정도를 알아보기 위하여 MTT assay를 수행한 후 구해진 IC50 값을 토대로 SNP 분석결과와 비교해 보았다. 그 결과 RRM1의 변이(2464 G>A)를 가지는 8 개의 세포주에서 gemcitabine에 대한 감수성이 증가한 것을 관찰할 수가 있었다. 또한 RT-PCR 과 western blot 을 통하여 RRM1의 mRNA와 단백질 발현 정도를 살펴 본 결과 RRM1의 유전적 변이를 가지는 8개의 세포주에서 mRNA와 단백질 발현 정도가 변이를 가지지 않는 세포주에 비해서 감소하는 경향을 관찰할 수 있었다.결론적으로 본 연구에서는 gemcitabine 단독 치료를 수행한 유방암 환자의 말초혈액 단핵구세포(PBMC)에서 추출한 genomic DNA를 이용하여 RRM1 유전자를 약제에 대한 부작용과 치료효과를 예측할 수 있는 생물학적 표지자로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

[영문]We examined the pattern of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of gemcitabine metabolism-related genes in breast cancer, and evaluated its possibility as a predictive marker for drug response and toxicity. SNPs in deoxycytidine kinase (dCK), deoxycytidine monophosphate deaminase (DCTD), and ribonucleotide reductase M1 polypeptide (RRM1) were analyzed with genomic DNA of 10 breast cancer cell lines, 76 peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from advanced breast cancer patients treated with gemcitabine, and 56 PBMC from healthy volunteers using CEQTM 8000 Genetic Analysis System (Beckman). The incidences of SNPs of breast cancer patients were 1.4 % of dCK (626 A>G), 10.8 % of DCTD (315 T>C), 40.5 % of the 1st RRM1 (2455 A>G), 44.6 % of the 2nd RRM1 (2464 G>A) and 23 % of both RRM1 sites, which were similar to normal control group. Especially, we found the 2 SNP of RRM1, 2455 A>G and 2464 G>A to be the novel sites. We observed that the variations in both RRM1 sites were associated with neutropenia (p < 0.01) and G-CSF requirements (p < 0.005). In addition, 3 out of haplotypes of RRM1 were significant based on Hardy-Weinberg equation. Meanwhile, no genotype did show an association with the tumor response.IC50 of gemcitabine in 10 breast cancer cell lines were determined using MTT assay. Comparing the pattern of SNPs with IC50 of gemcitabine, we observed the 8 cell lines with RRM1 (2464 G>A) variation showed increased sensitivity to gemcitabine. Also, we observed the 8 cell lines with RRM1 variation showed decreased mRNA and protein expression level of RRM1.In conclusion, RRM1 genotyping in PBMC might be a useful biomarker to predict the toxicity and the response of gemcitabine monotherapy in breast cancer patients.