실험적 간질에서 Matrix metalloproteinases의 발현과 역할

Abstract

[한글]

간질의 발생기전은 아직 확실하지 않지만 징후성 부분간질의 경우에는 뇌 손상으로 기인된 뇌세포 손실과 이를 보상하기 위한 뇌조직의 재구성이 중요한 기전으로 생각되고 있다. Matrix metalloproteinase(MMP)는 조직의 재구성에 관여하는 물질로써 몇몇 중추신경계 질환에서 급성기에 이의 발현이 증가한다고 보고되었다. 본 연구는 간질의 병인과 관련되어 MMP의 발현과 역할을 규명하기 위한 목적으로 수행되었다. 간질 모델로는 C57/BL 6 마우스에서 pilocarpine 투여에 의한 급성 중첩성 간질모델을 사용하였으며 급성 간질과 지연 간질의 임상 양상과 전기생리학적인 특성을 동시에 관찰하기 위해 video-EEG 모니터링 장치를 이용하였다. 급성 간질 발생 후 마우스 해마에서 MMP의 발현을 gelatin zymography와 Western blotting으로 관찰하였고, 세포 손실은 cresyl violet 염색으로 관찰하였으며 세포고사는 TUNEL 염색으로 관찰하였다. 발현된 MMP의 역할을 보기 위해 MMP 억제제를 투여한 후 급성 간질의 양상을 관찰하였으며, 지연 간질에서의 MMP의 역할을 알기 위해 급성 간질 유발 이후 MMP 억제제를 투여하고 2주 후 지연 간질을 관찰하였다. Pilocarpine을 복강으로 투여하였을 때 모든 마우스에서 간질중첩증이 관찰되었다. Racine 분류 3의 간질이 나타나는 평균 시간은 8.6+3.3분 이었고 Racine 분류 5의 간질이 나타나는 평균 시간은 29.4+7.4분 이었다. Racine 분류 5의 간질의 평균 횟수는 6.6+2.2 회였다. 사망률은 10%였다. 급성 간질은 간질 유발 이후 6시간까지 지속하다가 자발적으로 소실하였다. MMP-9 억제제를 간질 유발 전에 투여한 경우에는 Racine 분류 3의 간질이 나타나는 시간이 연장되었으며 Racine 분류 5의 간질은 관찰되지 않는 등 간질이 약화되는 양상을 보였다.Gelatin zymography에서 MMP-9의 발현 증가는 급성 간질 3일 후에 가장 높았다가 그 후 감소하여 급성 간질 14일 후에는 MMP-9 발현이 간질 유발전의 수준으로 환원되었으며 이러한 MMP-9 발현의 증가는 Western blotting에 의해서도 확인되었다. MMP-2의 발현은 급성 간질 전후에 변화가 없었다. MMP-9 발현 증가는 뇌실 내로 MMP-9 억제제의 투여에 의해 감소하였는데 간질 유발 전에 투여한 경우에서 간질 유발 후에 투여한 경우보다 더 많이 감소하였다.급성 간질 유발 후 해마의 세포손실을 cresyl violet 염색으로 관찰하였을 때 해마의 CA1 과 CA3 부위의 현저한 세포손실이 급성 간질 유발 3일 후에 관찰되었으며 이러한 세포손실은 14일 후에 원래의 수준으로 회복되었다. 세포고사를 보기 위한 TUNEL 염색에서 급성 간질 유발 3일 후에 CA1 및 CA3에서 TUNEL 염색이 현저히 증가되었으나 14일 후에는 TUNEL 염색이 거의 관찰되지 않았다. MMP-9 억제제를 처치한 경우에는 급성 간질 유발 3일 후에 CA1 및 CA3 세포손실이 현저히 감소되었으며 TUNEL 염색증가도 억제되었다.이끼세포 발아를 보기 위한 Timm 염색에서는 급성 간질 유발 14일 후에 마우스 해마의 이끼세포 발아가 관찰되었으며 MMP-9 억제제 투여한 경우에 이끼세포 발아가 감소하였다.급성 간질 2주 후의 지연 간질은 급성 간질에서 생존한 75%의 마우스에서 관찰되었으며 간질 횟수는 시간당 평균 0.24+0.80회였고, 평균 지속 기간은 40.19+8.70초였다. MMP-9 억제제를 투여한 마우스에서는 지연 간질이 급성 간질에서 생존한 마우스의 80%에서 관찰이 되며 간질 횟수는 18시간당 평균 3.25+2.17회였고 평균 지속 시간은 38.15+17.17초로 지연간질의 양상이 MMP-9 투여 여부에 따라 의미 있는 차이가 없었다.이상의 결과를 종합할 때 pilocarpine 투여에 의한 마우스의 급성 간질에서 해마의 MMP-9 발현의 증가와 세포손실이 발생하고 이는 시간이 경과됨에 따라 원상태로 회복되며 이러한 세포손실의 회복은 신경재생(neurogenesis)에 의한 것으로 추측되었다. MMP-9 억제제를 투여하여 MMP-9 발현을 억제하였을 때 마우스 해마 세포의 손실과 세포고사의 감소가 관찰됨으로 간질 발생에 의한 MMP-9 발현이 급성 간질에 의한 세포고사 및 세포손실의 기전에 관여 하는 것으로 생각되었다. 또한 MMP-9 억제제를 전처치한 모델에서 급성 간질의 발현 및 증상의 정도가 의미 있게 감소하는 등 MMP-9 억제제가 pilocarpine모델에서 항 간질효과를 가지고 있음을 시사하였다. 지연 간질 발생의 중요한 기전으로 설명되고 있는 이끼세포 의 발아는 MMP-9 억제제를 투여하였을 때 현저히 감소하였으나 지연 간질의 발생은 대조군과 비교하여 의미 있는 차이가 없었다는 사실도 이끼세포 발아와 MMP-9 발현 간에는 연관성이 있으나 이끼세포의 발아와 지연 간질의 발생에는 직접적인 연관성이 없음을 시사하였다.MMP 발현과 간질의 상호관계를 규명하기 위해 다양한 간질 모델에서 MMP 억제제에 의한 억제 이외에 유전자 조작 등과 같은 다양한 방법에 의한 MMP 발현 조절 후 MMP와 간질과의 관계에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

[영문]To explore the expression and their roles of MMPs in experimental seizures, we have developed acute and delayed seizure models in male C57BL/6 mouse by intraperitoneal administration of pilocarpine. We also adopted video-EEG seizure monitoring system for evaluation of mouse seizures semiologically and electrophysiologically.All mice developed status epilepticus(SE) after pilocarpine administration. Mean onset time of Racine's category 3 seizures was 8.6+3.3 minutes and mean onset time for Racine's category 5 seizures was 29.4+7.4 minutes. Mean number of Racine's category 5 seizures was 6.6+2.2. Mortality rate of acute seizure was 10%. SEs continued up to 6 hours after the onset of seizures. MMP-9 inhibitor administered mice before pilocarpine treatment showed decreased seizure activities such as mean onset time of Racine's category 3 seizures or induction rate of SE.Elevated expression of MMP-9 after SE was noticed by gel zymography, Western blotting. In gel zymography, elevation of MMP-9 expression after SE began at 3 days after SE. The level of MMP-9 expression was maximal at 3 days after SE. Elevated MMP-9 expression declined from then. The level of MMP-9 expression returned to baseline at 7 days after SE. MMP-2 expression was detected by gel zymography and the level of MMP-2 expression was constant and did not change after SE. The elevation of MMP-9 expression was decreased after administration of MMP-9 inhibitor intraventrically. Decrease of MMP-9 expression was more prominent when MMP-9 inhibitor administration was performed before pilocarpine administration than after SE.3 days after SE, partial cellular deterioration in CA1 and CA3 regions of hippocampus was noticed in cresyl violet staining. 14 days after SE, cellular loss in CA1 and CA3 regions was restored and did not show significant difference in cell number comparing to control. Cellular loss after SE and amelioration of cellular loss by MMP-9 inhibitor was also observed in PI staining.In TUNEL staining for apoptosis after SE, TUNEL-stained cells appeared 3 days after SE. At 14 days after SE, TUNEL-stained cell was not noticed. With MMP-9 inhibitor administration, TUNEL-stained cells decreased at 3 days after SE.Mossy fiber sprouting(MFS) was observed in the inner molecular layer at 14 days after SE by Timm staining. MFS was not observed in MMP-9 inhibitor treated mice even after SE.2 weeks after SE, delayed seizures were observed in 75% of surviving mice. Mean number of delayed seizures was 3.25+2.17and mean duration of delayed seizures was 38.15+17.17 seconds. Administration of MMP-9 inhibitor did not alter in induction rate, duration and frequency of delayed seizure.This study demonstrated elevation of MMP-9 expression in pilocarpine induced SE but MMP-2. Inhibition of MMP-9 expression alleviated cell loss, apoptosis and MFS after SE but did not influence on delayed seizure. These findings suggest that MMP-9 seemed involve in cell loss, apoptosis and MFS after SE. Further more, cell loss, apoptosis and MFS mediated by MMP-9 expression after SE may not involve in development of delayed seizure. Mitigating pilocarpine induced seizure by MMP-9 inhibitor suggested that MMP-9 seemed involved in pilocarpine induced seizure and could be a target molecule for antiepileptic agent.