백서배자의 구개발생 과정 중 Tbx3, Bmp4와 Shh 발현양상

Abstract

[한글]

두개 및 안면의 성장과 발육 과정중에서 분리된 두 개의 이차구개판은 성장, 상승, 개조 및 융합이라는 몇 단계의 과정을 거쳐서 정상적인 구개의 형태형성 (morphogenesis)을 하게 된다. 구개판내의 외배엽성 상피와 중배엽의 신호전달물질인 Bmp4와 Shh이 이러한 일련의 과정중에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 전사인자인 Tbx3의 경우, 사지의 발생과 같은 다양한 장기의 발생과정동안 Bmp4와 Shh과 연관되어 중요한 작용을 한다. 본 연구에서는 백서 배자의 이차구개발생동안 융합시기와 차이를 보이는 이차구개판의 전방과 후방 구개발생의 형태학적 차이를 관찰하고 배자기 13.5기 (Embryonic day 13.5 ; E13.5)와 14.5기 (E14.5)에서 Tbx3, Bmp4와 Shh의 발현양상을 관찰하여 이들이 전방과 후방의 구개발생 과정중에 어떠한 기능을 수행하는지 규명하고자 하였다. 백서 배자를 배자기 13.5기 (E13.5)에서 채취하여 Tbx3, Bmp4와 Shh의 발현양상을 관찰하기 위하여 제자리부합법 (in situ hybridization)을 시행하였다. 편측의 구개판의 위치는 정상으로, 반대편의 구개판은 180° 회전하여 위치시키는 역전체외배양 (Reverse in vitro culture)을 시도하여 전방과 후방 이차구개판의 신호전달물질의 발현양상과 형태학적 변화양상을 관찰하였다. 전기유전자도입법 (Electroporation)을 이용하여 Tbx3, Bmp4와 Shh를 편측 이차구개판에서 과발현시키고, 반대편 이차구개판을 대조군으로 설정하여 전방과 후방 구개판의 발생과정중에 미치는 영향을 관찰하였다. 이차구개판의 상피가 이차구개판의 발생에 미치는 영향을 확인하고자 중배엽으로부터 상피를 분리하고, 재조합하는 실험을 시행하였다. 또한 체외배양된 구개판의 세포증식을 PCNA (Proliferation Cell Nucleus Antigen) 면역조직화학방법으로 확인하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.1. Tbx3와 Bmp4는 이차구개판의 전방부위의 중배엽에서만 발현되며, 후방에서는 발현되지 않았다. Shh는 전방과 후방 이차구개판의 상피에서 확인되었다. Tbx3는 구개판의 융합과정에는 직접적으로 작용하지 않았다2. Tbx3, Bmp4와 Shh를 각각 과발현시킨 결과, Tbx3의 과발현은 Bmp4와 Shh의 발현을 억제 (down-regulation)하였고, Bmp4의 과발현은 Shh를 억제하고, Tbx3를 촉진 (up-regulation)하였으며, Shh의 과발현은 Tbx3를 촉진하고, Bmp4를 억제하였다. PCNA 면역조직화학방법으로 세포증식을 확인한 결과, 전기유전자 도입법으로 Tbx3를 과발현시킨 이차 구개판부위에서 대조군에 비하여 세포증식이 증가된 것을 관찰하였다. Anti-SHH 5E1을 이용하여 체외배양한 구개조직에서만 Shh뿐만 아니라, Tbx3와 Bmp4의 발현까지 억제되었다.3. 구개판 상피를 간엽조직에서 분리한 결과, 전방 이차구개판에서는 Tbx3와 Bmp4가 발현되지 않았으며, 후방 이차 구개판부위에서는 정상적으로는 관찰되지 않던 Bmp4가 발현되었다. 구개상피를 재조합한 경우, Tbx3와 Bmp4의 발현이 회복되었다.본 연구의 결과를 종합하면, 백서 배자의 이차구개판의 발생과정중 외배엽 상피와 중배엽의 상호작용 (epithelial mesenchymal interaction)과정에서 상피와 중배엽내에 위치한 신호전달물질인 Tbx3, Bmp4와 Shh의 발현이 발생중인 전방과 후방 이차 구개판부위에서 서로 다르게 작용하며, Tbx3와 Bmp4는 구개판의 간엽세포증식과는 밀접하게 연관된 것으로 생각된다. Bmp4와 Shh는 서로 억제하며 이들 두 가지 신호전달물질은 Tbx3를 유도하였다. Bmp4와 Shh는 전사인자 Tbx3에 의하여 억제 조절된다. 결론적으로 상피(외배엽)-중배엽에 존재하는 전사인자들간의 상호작용이 이차구개의 형성과정에서 중요한 역할을 하며, 구개상피에 위치한 Shh을 포함한 구개상피인자가 이차구개발생과정중 구개판 형태와 크기결정을 위한 세포증식반응을 시작하는 핵심적인 인자로 판단된다. Tbx3는 Shh와 Msx1을 매개하는 Bmp4와 Shh사이에서 이들을 조절하는 중간매개자 역할을 하는 것으로 유추된다. 이차구개의 형성과정에서 구개판의 형태와 크기를 결정하는 간엽세포증식을 보다 명확하게 이해하기 위해서는 이에 관여하는 Tbx3의 정확한 신호전달기전과 역할 및 알려지지 않은 구개상피인자에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.

[영문]Craniofacial malformation is the most common birth defects that occur in humans. During the secondary palate development, two shelves elevated to a horizontal position above the tongue, then they completely fused in developing embryo. Many previous studies have concentrated on the relationship among signalling molecules, which affect the epithelial mesenchymal interaction during the palatogenesis. In this study, I examined the expression pattern of the specific signalling molecules, Tbx3, Bmp4 and Shh demonstrating the signalling cascade of these genes and the differential expression pattern along the anterior-posterior axis of developing secondary palate. Furthermore, mutual interaction of these genes can explore to be considered as similar molecular network existing in other system such as limb bud and mammary gland.1. Tbx3 thus controls genetic hierarchy involving Bmp and Shh signals that regulates the growth of the anterior region of palate during mammalian palatogenesis, which provide insights into the morphology and size determination of developing palate. The definitive morphological differences are between anterior and posterior parts of the developing palate in mouse secondary palatogenesis. Tbx3 expression level was not related with palatal fusion process.2. Molecular network among Tbx3, Bmp4 and Shh, is significant for distinguished expression patterns at E13.5 and E14.5. Because these molecules are plays important roles in other related developing organs, such as limb and mammary gland. By electroporation method of individual genes, the effect of over-expression for determination of signalling cascade among Tbx3, Bmp4 and Shh. Interestingly, Tbx3 expression level was up regulated by Bmp4 and Shh over-expression in palate. In anterior region, mesenchymal factor Tbx3 would be positively regulated by Bmp4 expression in mesenchyme and Shh expression in epithelium. It suggests Bmp4 and Shh can switch on the expression of Tbx3 in palatal development. Tbx-3over-expression definitely down regulated the expression level of Bmp4 and Shh, in both anterior and posterior region. These results suggest that Tbx3 is directly related with and down regulate Bmp4 and Shh in normal palatogenesis. Moreover, Bmp4 and Shh were co-regulated by each other. Shh expression was down regulated by over-expressed Bmp4. And then Bmp4 was down regulated by Shh over-expression.3. After removal of palatal epithelium from mesenchyme for understanding the epithelial function, which includes Shh signalling in developing palate, Tbx3 and Bmp4 expression were not detected. But Tbx3 .and Bmp4 expression were rescued by recombining palatal epithelium from anterior palate.Our results show that epithelial-mesenchymal interactions are essential to Tbx3 signalling with Bmp4 and Shh expression. In conclusion, Bmp4 and Shh, down regulated each other and these signalling molecules positively regulated expression of Tbx3 in the secondary palate. Signalling molecules Bmp4 and Shh are negatively regulated by transcriptional factor. Tbx3, Bmp4 and Shh are important signalling molecules during secondary palate development and related with cell proliferation in the palatal mesenchyme. But the exact mechanims for determination of size and morphology of developing palate. and the specific roles of Tbx3, Bmp4 and Shh were not revealed yet . More schematic and sequential studies will be needed for searching the whole process of secondary palatal development and signalling network involving epithelial-mesenchymal interaction during palatogenesis.