Redox-dependent regulation of neurite outgrowth induced by staurosporine and Y-27632 in PC12 cells

Abstract

[한글]

세포 내 산화 환원 상태는 다양한 세포의 신호 전달 기전에 매우 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 있다. 본 실험에서는 PC12 세포에서 staurosporine (STS)과 Y-27632에 의해 유도되는 신경 돌기 성장 기전에 활성 산조종의 관여 여부와 그 역할에 대한 연구를 수행하였다. 다양한 단백질 kinase 억제제인 STS와 Rho-associated kinase 억제제인 Y-27632는 신경 성장 인자 (NGF)가 유도하는 신경 돌기 성장과는 달리 1시간 안에 빠르게 신경 돌기 성장을 유도하였다. 최근의 연구 결과에 따르면 신경성 세포의 분화에 있어 Rho와 Rac은 상반되는 기능을 가진다고 보고 되었다. 이러한 결과와 일치하게 PC12 세포에서 STS와 Y-27632로 Rho의 하위 신호 전달을 억제 하였을 때 30분 안에 Rac1 단백의 활성이 확인되었다. 게다가, dominant negative Rac1N17 돌연변이 유전자를 과발현 시킨 PC12 세포에 STS와 Y-27632를 처리하였을 때 형태 변화가 유도되지 않았다. Rac1 활성에 의해 유도되는 활성 산소종이 STS와 Y-27632가 유도하는 신경 돌기 성장에 관여 하는지를 확인하기 위해 항산화제인 N-acetyl- cysteine (NAC)와 flavo-단백 억제제인 diphenyleneiodonium (DPI)를 전 처리하였을 때 STS와 Y-27632에 의해 유도되는 신경 돌기 성장이 억제 되었다. 또한 신경 돌기 성장을 유도하는 최소 농도의 STS와 Y-27632에, 100 μM H2O2를 함께 처리하는 경우 신경 돌기 성장이 촉진 됨을 확인하였다. DCF-DA를 이용하여 세포내 활성 산소종을 탐지하는 실험에서도 STS와 Y-27632에 의한 활성 산소종의 증가가 확인되었고 constitutively active (CA) Rac1V12 돌연변이 유전자를 PC12 세포에 과발현 시켰을 때 역시 세포내 증가된 활성 산소 종을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과들을 통해 STS와 Y-27632이 유도하는 PC12 세포의 신경 돌기 성장에 있어 Rac1 단백의 활성이 유도하는 세포내 활성 산소종이 중요한 조절자라는 것을 확인하였다. 그러나 wild type Rac1 유전자와 CA Rac1V12 돌연변이 유전자를 세포내 주입하여 발현 시켰을 때나, H2O2 를 단독으로 세포 외부에서 처리하였을 때 PC12 세포의 신경 돌기성장이 유도되지 않았다. 면역 염색법을 통해 Rac1 단백의 분포를 확인한 결과, STS와 Y-27632에 의해 유도된 신경 돌기 말단에 Rac1이 재분포 되는 것을 확인되었다. 또한 세포 형태 변화를 위해 새롭게 형성되는 actin 단백과 Rac1 단백이 신경 돌기 말단에 함께 분배 되어 있었다. 결론적으로 신경 돌기 말단에 위치한 Rac1 단백의 활성과 그에 따른 활성 산소종의 생성이 STS와 Y-27632가 유도하는 PC12 세포의 신경 돌기 성장 기전에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.

[영문]The cellular redox state is thought to play an important role in a wide range of cellular signaling pathways. In this study, I investigated the regulatory roles of ROS in staurosporine (STS)- and Y-27632-induced neurite outgrowth, which is a major hallmark of the differentiation phenotype, in PC12 cells. In comparison to NGF-induced neurite outgrowth, STS, a broad spectrum inhibitor of protein kinases, or Y-27632, a Rho-associated kinase inhibitor rapidly induced neurite outgrowth within 1 h. Recent studies indicate that Rho and Rac have opposite functions in neuronal differentiation. In agreement with this, it was shown that inactivation of Rho downstream by treatment STS and Y-27632 had an effect on Rac1 activity in PC12 cells within 30 min. In addition, the expression of dominant negative Rac1N17 blocked morphological differentiation caused by STS and Y-27632. To investigate the role of Rac1-induced ROS production in STS- and Y-27632-induced neurite outgrowth, N-acetylcysteine (NAC), an antioxidant, was used. Pretreatment with NAC effectively suppressed 100 nM STS- and 100 μM Y-27632- induced neurite outgrowth. Also, Diphenylen- iodonium (DPI), which inhibits a flavo protein such as NADPH oxidase, showed the similar inhibitory effect on the neurite outgrowth to NAC. Next, H2O2 (100 μM) in the presence of 10nM STS or 10 μM Y-27632 (lower concentrations than those inducing neurites) was treated, to examine whether it facilitated the neurite outgrowth. The co-treatment notably stimulated the rapid neurite outgrowth. Using DCF-DA, the increase of ROS production by Y-27632 and STS was also detected. In addition, constitutively active form of Rac1, Rac1V12, increased the intracellular ROS level. These results implicate that STS and Y-27632 stumulate the generation of an oxygen radical, perhapse H2O2, via Rac1 activation, which is required for STS- and Y-27632-induced morphological changes. However, treatment of cells only with H2O2 did not cause the neurite outgrowth. In addition, only overexpression of wild type Rac1 and CA-Rac1V12 in PC12 cells could not induce neurites from the cells, indicating that the activation of Rac1 and ROS production are not sufficient for inducing neurite outgrowth in PC12 cells. Therefore, the Rac1 localization upon STS and Y-27632 treatment was examined in PC12 cells. Using immunocytochemistry, the appropriate relocalization of Rac1 at the end tips of neurite was observed after the treatment of STS and Y-27632. Newly formed actin filaments which are required for the morphological changes were also located in the end tips of neurites with Rac1. In conclusion, these results suggest that both the activation of Rac1 at the tips of neurites and Rac1-mediated ROS production may play an important role in the neuritogenesis induced by STS and Y-27632 in PC12 cells.