Anti-tumor effect and radiation response modification by tyrosine kinase inhibitor imatinib mesylate on pancreatic cancer cells

Abstract

[한글]

인체의 췌장암은 1년 생존율이 20% 미만인 예후가 불량한 암이다. 근치적 절제가 가능한 10-20% 내외에서도 2년 생존율이 10% 내외에 불과하며 대부분의 환자는 진단 후 6개월 내외에 사망에 이른다. 기존의 항암제나 방사선 치료 등은 췌장암에 있어서는 다른 암종에 비해 두드러지게 약제 저항성을 보이고 있어 그 효과가 미미하다. 비록 1999년 이후 gemcitabine이 췌장암에 보다 효과적인 항암 약제로 개발되어 사용되고 있으나 이외의 약제는 거의 효과가 없으며, 이 역시 생존율 향상에 큰 영향을 끼치지는 못하였다. 최근 들어 분자 생물학적 연구를 바탕으로 하여 암 발생 과정에서 관여하는 생장 호르몬 같은 단백질을 주 공격 목표로 하는 약물 개발이 활발히 진행되고 있는데, 이 중 하나가 protein tyrosine kinase로써 대표적인 약제가 현재 만성 골수성 백혈병에 효과적으로 쓰이고 있는 imatinib mesylate (STI-571, Gleevec , Glivec )이다. 이는 Bcr-Abl, PDGFR, c-Kit 수용체의 인산화를 선택적으로 억제하는 약물로 알려져 있는데, 따라서 c-Kit과 PDGFR 수용체 양성을 보이는 췌장암에서 향후 항암 효과를 기대해 볼 수 있는 항암제로 대두되고 있다. 따라서 본 연구는 췌장암 세포주에 있어서 imatinib mesylate의 항암 효과 및 그 기전을 살펴보고 임상적인 적용을 위한 연구를 실시하였다. 실험은 4개의 췌장암 세포주(BxPC-3, HPAC, MiaPaCa-2, Panc-1)과 c-Kit, PDGFR 음성인 정상 세포주인 NIH3T3 (음성 대조군)을 이용하여 실험을 진행하였다.

1. 췌장암 세포주는 세포주에 따라 차이를 보이기는 하나, 전반적으로 볼 때 imatinib mesylate에 대하여 약제 농도와 노출 시간에 비례하는 항암 효과를 나타내었다. 그러나 c-Kit과 PDGFR 수용체를 가지는 다른 세포주들에 비해 상대적으로 높은 IC50값을 보였다.

2. 췌장암 세포들이 imatinib mesylate 에 대해 항암 효과를 보이는 것은 세포 증식의 억제에서 기인하기 보다 세포 사멸 유도에 기인되는 것으로 관찰되었다. (Annexin V/PI assay, DAPI 염색)

3. FACS를 이용한 세포 주기를 관찰한 결과 약물 노출 48시간 경과 후 약간의 S 상의 지연이 관찰되었으나 뚜렷하지 않았다. 그러나 시간이 지남에 따라 증가되는 세포 사멸 세포들을 관찰할 수 있었다. (Cell cycle analysis by FACS)

4. 세포 사멸에 관계되는 단백질을 약물 노출 72시간에 western blot으로 관찰한 결과 BCL-2가 감소하고 Bax가 증가하였다. Caspase 관련 신호 전달체계의 가장 마지막 단계인 caspase-3는 초기 6시간 내에 급격히 감소하였다가 시간이 경과함에 따라 서서히 본래의 수준 가까이 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 72시간까지 관찰한 결과 약물을 처리한 세포에 있어서 처리하지 않은 세포에 비해 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다.

5. Western blot을 실시한 결과 imatinib mesylate 처리에 의해 c-Kit과 PDGFR의 총량이 변하는 것이 아니라 인산화가 감소됨을 관찰하였다. 즉, 기능적인 면에서 억제가 됨을 알 수 있었다.

6. c-kit과 PDGFR관 관련된 세포 전달 단백질 중 생존과 분화, 증식에 관련되고 췌장암에서 발현하는 단백질, p-Akt, p-erk, p-PLCγ의 발현이 imatinib mesylate에 영향을 받는지 western blot을 이용해 관찰한 결과 p-Akt과 p-PLCγ은 감소되었으나 p-erk은 변화를 보이지 안았다.

7. 췌장암 세포주를 각각 5μM, 10μM, 20μM 농도의 imatinib mesylate에 1시간 정도 노출시킨 후 0, 1, 3, 6 Gy의 방사선에 노출시킨 후 14일 후에 증식 여부를 관찰한 결과 방사선에 대해 치료 상승효과를 관찰할 수 있었다. 이는 imatinib mesylate 노출 시간에 영향을 받는데, 노출 시간이 길수록 상승효과는 증가되어 2시간이 최대를 보이고 있으나 2시간 이후로는 오히려 효과가 감소되는 현상을 관찰하였다.

이상으로 췌장암에 있어 imatinib mesylate 의 방사선 상승 효과는 c-kit 수용체의 인산화 억제로 기인된 p-PLCγ의 억제로 p-PLCγ에 의해 발생된 radioprotective 효과를 억제함으로써 발생되는 것으로 추정하였다. c-Kit과 PDGFR 양성인 다른 세포주들에 비해 췌장암 세포주는 imatinib mesylate에 대해 상대적으로 미미한 항암 효과를 보이나 세포 사멸을 유도하고 있고 또한 radiosensitization의 효과를 지니고 있어 임상적으로 단독 사용은 무리가 있으나 병용치료에 이용될 때 기존의 치료에 저항을 보이는 췌장암 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각하였다.

[영문]Pancreatic cancer has a very poor prognosis with less than 20% of 1-year survival. Conventional oncologic strategies, such as chemotherapy and radiotherapy are resistant. Imatinib mesylate (STI-571, Gleevec , Glivec ), is a selective signal transduction inhibitor of the c-Kit, Bcr-Abl, and platelet-derived growth-factor receptor (PDGFR) tyrosine kinases. Recently, target-therapy concept is prevalent and this drug has been actively investigated. Here, we tried imatinib mesylate to pancreatic cancer cells and investigated the anti-tumor effect and its mechanism. And, for clinical usefulness, we evaluated the radiosensitizing effect of imatinib mesylate to pancreatic cancer cells. In result, imatinib mesylate inhibited the growth of pancreatic cancer cells in dose and time-dependent manners with the range of 18-47μM of IC50 after 48 hours and 15-39μM after 72 hours exposure. Imatinib mesylate caused the programmed cell death through the interruption of function of c-Kit or PDGF receptor and its downstream proteins PI3K/Akt and PLCγ. Slight delay of S-phase progression was also observed. For the evaluation of radiosensitizing effect, pancreatic cancer cells was incubated for 1 hour with 5, 10, 20μM of imatinib mesylate and 1, 3, 6 Gy of irradiation was delivered. Clonogenic survival assay revealed the novel radiosensitizing effect of imatinib mesylate in pancreatic cancer cells, and suggested the potential clinical usefulness.

These results suggest a promising therapeutic impact of low dose imatinib mesylate in combination with radiation in pancreatic cancer.