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Mycobacterium tuberculosis sigB 유전자에 존재하는 SigH-와 SigE-의존적 promoter의 염기서열분석

Other Titles
 Sequences analysis of the overlapping SigH- and SigE-dependent promoters of sigB gene in Mycobacterium t 
Authors
 송승은 
Issue Date
2005
Description
의과학과/석사
Abstract
[한글] 병원성세균들은 숙주에 감염하여 질병을 유발하는 과정에서 숙주의 방어기작에 따른 다양한 환경의 변화에 노출된다. Extracytoplasmic function (ECF) 계열의 sigma factor들은 미생물이 이러한 environmental stress에 저항하는데 필요한 유전자발현에 있어서 매우 중요한 조절인자로 알려져 있다. 결핵균의 genome에는 13개의 sigma factor 유전자가 존재하는데 이 중 10개가 ECF 계열에 속한다. 이들 가운데 sigE와 sigH 유전자의 돌연변이가 결핵균의 병독성에 영향을 미치며 실제로 이들 유전자의 산물인 SigE와 SigH는 oxidative stress와 heat stress에 대한 결핵균의 유전자발현 조절기작에서 부분적으로 겹쳐지는 유전자 집단의 전사를 매개하는 것으로 밝혀졌다. SigE와 SigH는 다른 sigma factor, SigB와 더불어 결핵균의 stress에 대한 반응에서 중심적인 regulatory network을 구성하고 있는데, 외부 자극에 따라 SigH가 sigE 유전자의 발현을 유발하며 SigH와 합성된 SigE가 sigB 유전자의 전사를 촉진한다. 따라서 이들 sigma factor 유전자들의 발현에 매우 정교한 조절기작이 존재하며 두개의 sigma factor, SigE와 SigH가 sigB 유전자의 promoter를 인식할 것으로 예상된다. 각 sigma factor가 인식하는 promoter들의 염기서열 분석하기 위하여 sigB 유전자에서 이미 알고 있는 SigH-의존적 promoter의 -35와 -10 지역을 대상으로 -35 지역에 16개, -10 지역에 12개 위치에 돌연변이를 도입하고 SigE와 SigH에 대한 promoter 활성에 미치는 각 돌연변이의 영향을 관찰하였다. 정제한 SigH, SigE와 대장균의 RNA polymerase core enzyme을 재조합하여 사용한 in vitro transcription assay를 통하여 SigH와 SigE가 거의 유사한 -35 지역에 결합하며 각각 염기서열, GGAA(T/c)(A/t)와 GGAACTC(A/C)를 인식하는 것을 확인하였다. 각 sigma factor가 인식하는 -10 지역의 염기서열도 서로 중복되어 있으며 SigH는 GTT, SigE는 (C/a)GTT 염기서열을 선호하였다. 이외에 아직 확실하게 규명되지 않은 다른 부위의 염기서열이 각 돌연변이 promoter의 전사에 영향을 줄 가능성도 있음이 제시되었다. 위에서 밝혀진 각 sigma factor들의 promoter 염기서열에 대한 세포내 결합특이성은 야생형 혹은 각 sigma factor 유전자의 돌연변이체 M. smegmatis를 대상으로 transcriptional lacZ fusion을 이용하여 돌연변이 promoter들의 전사활성을 측정하여 확인하였다. 이 연구를 통하여 얻어진 각 sigma factor가 인식하는 promoter 염기서열에 대한 정보는 이들에 의하여 조절되는 유전자집단(regulon)에 대한 분석을 가능하게 함으로써 장차 보다 자세한 조절기작에 대한 연구와 더불어 결핵균의 병원성과 관련이 있는 세포내 유전자발현 조절기작의 규명에 기여할 것이다.
[영문]Sigma factors of the extracytoplasmic function (ECF) family are the major regulators of gene expression in the bacterial response to environmental stresses that pathogenic bacterias are likely to encounter during the course of infection. Mutations in sigE and sigH of Mycobacterium tuberculosis, encoding an ECF sigma factor respectively, affect virulence of the pathogen, and SigE and SigH were found to mediate expression of partially overlapping sets of genes in response to oxidative and heat stresses. Together with another sigma factor, SigB, SigH and SigE form a regulatory network where SigH directs expression of sigE, and both SigH and SigE, in turn, facilitates transcription of sigB, implying a complicated regulatory mechanism exists and both the sigma factors recognize similar sequence of the sigB promoter. To investigate the sequences of SigE- and SigH- dependent promoters, mutations were introduced in the -35 and -10 regions of the SigH-dependent promoter of sigB gene and the binding of the sigma factors to the mutated sequences was monitored by in vitro transcription assay using purified SigH and SigE reconstituted with E. coli RNA polymerase core enzyme. SigH and SigE recognize the sequences of GGAA(T/c)(A/t) and GGAACTC(A/C), respectively, which overlap at the -35 region. At -10 region SigH binds strongly to the sequence of GTT while SigE prefers (C/a)GTT. Results from in vitro transcription assay employing the mutated promoters also imply the presence of other sequence elements that affect promoter strength. Specificity for the promoter sequences of both SigH and SigE was also confirmed by measuring transcription activity of the mutated promoters in Mycobacterium smegmatis, either wild type or sigH- and/or sigE-deleted. Discrimination between SigE and SigH regulons based on the promoter sequences revealed in this study, along with further investigation of the regulatory mechanism involved, should provide insight into the regulation of cellular functions of M. tuberculosis implicated in pathogenesis.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 2. Thesis
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/122416
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