흰쥐 췌장 선세포에서 H2O2가 아밀라제 분비과정에 미치는 영향

Abstract

[한글]

활성산소종 (reactive oxygen species)은 생체내 대사과정 중에 생성되는 부산물로서 당뇨병과 신경퇴행성질환과 같은 질병 유발에 관련이 있으며 동시에 세포의 생리적 작용을 매개하는 이차전령체로서의 역할도 가지고 있다. 그러나 활성산소종의 외분비 선세포에서의 생리학적인 역할에 대해서는 많은 연구가 이루어지지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 흰쥐 췌장 선세포에서 활성산소종인 H2O2가 CCK (cholecystokinin)에 의한 아밀라제 유리에 미치는 영향과 그 기전을 알아보고자 하였다.

세포는 흰쥐의 췌장에서 collagen digestion 과정을 통해 얻었으며 아밀라제 유리는 전분을 기질로 이용하여 Bernfeld의 방법에 따라 측정하였다. 먼저 췌장 선세포를 CCK로 자극하여 아밀라제 유리에 대한 농도-반응 곡선을 구하고 30 μM H2O2을 함께 처리하여 CCK에 대한 반응과 비교하였다. 30 μM H2O2을 함께 처리하였을 때 저농도의 CCK (≦10 pM CCK)에서는 아밀라제 유리를 항진시키고 100 pM 이상 농도의 CCK에서는 아밀라제 유리를 억제하였다. 췌장 선세포가 CCK에 의해 활성화될 때 활성산소종이 생성되어 아밀라제 유리에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 세포내 활성산소종을 없애는 항산화제인 MnTBAP를 처리하였다. 10 μM MnTBAP는 저농도의 CCK에 대한 효과는 거의 없었으나 고농도의 CCK에 의한 아밀라제 유리는 CCK를 단독 처리했을 때의 반응보다 증가하였다.

H2O2의 영향으로 CCK에 의한 아밀라제 유리 변화가 세포내 칼슘농도의 변화와 관련이 있는지 알아보기 위하여 칼슘 농도에 민감하게 반응하는 형광물질인 fura-2를 이용하여 세포내 칼슘 농도를 측정하였다. 20 pM CCK에 의해 칼슘 oscillations이 나타날 때 30 μM H2O2의 처리는 칼슘 oscillations의 빈도와 크기가 증가하는 양상을 보였지만 2 nM CCK에 의한 세포내 칼슘의 증가에는 영향을 미치지 못하였다. 또한 10 pM CCK에 의해 세포내 칼슘 oscillations가 유발될 때 항산화제인 1 mM NAC의 첨가는 칼슘 oscillations의 빈도에는 아무런 영향을 미치지 않았다.

이상의 결과를 토대로 췌장 선세포에서 30 μM H2O2가 직접 칼슘 oscillations를 유발하지는 않았지만, 저농도의 CCK가 IP3 의존성 칼슘 저장고로부터 칼슘 oscillations을 유발할 때 30 μM H2O2가 IP3 의존성 칼슘저장고에 작용하여 칼슘 oscillations를 증가시키고 아밀라제 유리를 항진시킨 것으로 생각된다. 그러나 고농도의 CCK에서 30 μM H2O2가 아밀라제 유리를 감소시킨 작용은 세포내에 아밀라제 유리에 관련된 단백에 직접 영향을 미치는 것으로 생각된다. 이는 앞으로 더 연구되어질 부분이다.

[영문]Reactive oxygen species (ROS) are known to be involved in the mediation of physiological functions in a variety of cell types. However, little has been known about the physiological role of ROS in exocrine cells. Therefore, in the present study, the effect of ROS on cholecystokinin (CCK)-evoked amylase release was investigated in rat pancreatic acinar cells. Cells were obtained from rat pancreas and amylase release from the cells was measured using a modification of methods described by Bernfeld. Stimulation of the acinar cells with CCK induced biphasic increase in amylase release. Addition of 30 μM H2O2 enhanced amylase release caused by 10 pM CCK, but inhibited the amylase release induced by CCK at concentrations higher than 100 pM. An ROS scavenger, 10 μM MnTBAP, increased amylase release caused by CCK at concentrations higher than 100 pM, although lower concentrations of CCK-induced amylase release was not affected by 10 μM MnTBAP. To examine whether the effect of ROS on CCK-induced amylase release was due to the modulation of intracellular Ca2+ signaling, we measured the changes in intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in fura-2 loaded acinar cells. Addition of 30 μM H2O2 increased the frequency and amplitude of [Ca2+]i oscillations caused by 20 pM CCK, but had little effect on 2 nM CCK-induced increase in [Ca2+]i. ROS scavenger, 1 mM N-acetyl-cysteine, did not affect [Ca2+]i changes induced by 20 pM or 2 nM CCK.

Therefore, it was concluded that, although 30 μM H2O2 did not induce [Ca2+]i oscillations, it increased the low concentrations of CCK-induced [Ca2+]i oscillations and amylase release. However, the inhibitory effect of ROS on high concentrations of CCK-induced amylase release did not appear to be mediated by inhibition of Ca2+ signaling.