Neuroprotective effect of SIN-1 on Zn2+-induced PC12 cell death

Abstract

[한글]

과산화질소 (ONOO-) 는 일산화질소 (NO) 과 활성산소 (O2-) 가 결합되어 생성된 활성 물질로서 체내에서 세포에 해를 끼치는 물질로 알려져 있다. 그러나 최근 과산화질소가 일산화질소에 의한 세포사를 막는다는 사실이 알려졌다.

따라서 이번 연구에서는 Zn2+가 신경세포로 분화된 PC12 세포 내에 축적되어 일어나는 세포사에 과산화질소가 끼치는 영향에 대해서 알아보고자 하였다.

Zn2+ (10 μM)를 Zn2+ 이온 투과 담체인 pyrithione (5 μM)과 함께 3시간 동안 처리하면 세포 안에 고농도의 Zn2+가 축적되어 세포사를 일으키는데, 과산화질소를 만들어 내는 SIN-1을 함께 처리하면 세포의 사멸이 일어나지 않는 것을 확인하였다.

먼저 SIN-1이 Zn2+가 세포 안으로 유입되는 것을 방해하는지 알아보기 위해 SIN-1을 전처리한 후 Zn2+와 pyrithione을 처리하였다. SIN-1과 Zn2+ 및 pyrithione을 처리한 실험군이나 Zn2+ 및 pyrithione 만 처리한 실험군 모두 세포 내로 Zn2+가 정상적으로 유입되는 것으로 보아 SIN-1이 세포 밖에서 Zn2+와 결합하여 Zn2+가 세포 안으로 들어가는 것을 방해함으로서 Zn2+의 세포사를 막는 것은 아님을 확인하였다.

SIN-1은 과산화질소 뿐만 아니라 일산화질소도 생성하므로, SIN-1이 Zn2+에 의한 세포사를 막는 것이 과산화질소의 영향인지 아니면 일산화질소의 영향인지 알아보고자 하였다. 따라서 또 다른 일산화질소 생성물인 SNP와 SNAP을 처리하였으나, 이들 약물은 SIN-1과 달리 Zn2+에 의한 세포사에 어떠한 영향을 끼치지 않았다. Zn2+에 의한 세포사에 대해서 SIN-1은 uric acid, trolox, L-methionine과 같은 과산화질소 포착제를 함께 처리할 경우에는 거의 효과를 나타내지 않았다. 또한 SIN-1이 분해되어 만들어지는 SIN-1C를 Zn2+와 함께 처리해도 Zn2+에 의한 세포사를 막지 못하였다. 마지막으로 SIN-1이 분해되면서 만들어지는 OH•를 제거하여도 세포사멸을 막는데는 아무런 효과도 나타내지 않았다. 앞의 결과를 토대로 과산화질소가 Zn2+에 의한 세포사를 막는데 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 앞으로는 어떤 기전에 의해 과산화질소가 Zn2+에 의한 세포사를 막는지 확인하는 실험이 필요하다고 생각한다.

[영문]Peroxynitrite is derived from nitirc oxide (NO) and is a highly reactive cytotoxic molecule. Recently, however, peroxynitrite was also shown to play a neuroprotective role against nitric oxide-mediated apoptosis. In the present study, the role of peroxynitrite in the neuronal cell death caused by intracellular accumulation of Zn2+ was investigated in the differentiated PC12 cells.

Intracellular Zn2+ concentration was measured using spectrofluorometry in magfura-2-loaded differentiated PC12 cells, and cell viability was assessed by MTT assay. Intracellular accumulation of Zn2+, which was induced by the combined application of pyrithione (5 µM), a zinc ionophore, and Zn2+ (10 µM) for 3 hours, caused cell death in differentiated PC12 cells.

The Zn2+-induced PC12 cell death was prevented by the pretreatment with 3-morpholinsydnonimine (SIN-1), a peroxynitrite donor. The intracellular accumulation of Zn2+ was not affected by the pretreatment with SIN-1, suggesting that the neuroprotective effect of SIN-1 was not due to the reduced influx of Zn2+ into cells. Since SIN-1 produces nitric oxide as well as peroxynitrite, we examined whether the protective effect of SIN-1 against PC12 cell death was attributed to nitric oxide or peroxynitrite. Pretreatment of cells with various nitric oxide donors, such as SNP and SNAP, was not able to attenuate the Zn2+-induced PC12 cell death. SIN-1C, the stable decomposition product of SIN-1, did not prevent the Zn2+-induced cell death. In addition, the protective effect of peroxynitrite against Zn2+-induced cell death was almost completely inhibited by the peroxynitrite scavengers, such as uric acid, trolox and L-methionine. In conclusion, peroxynitrite exerts neuro- protective effect against Zn2+-induced cell death in differentiated PC12 cells.