Telomere shortening in rat hepatic stem-like epithelial cells and subcellular localization of rat PinX1

Abstract

[한글]

랫의 상피 간세포인 LE/2, LE/6 와 WB-F344 세포는 간암 발생 초기 단계에서 관찰되는 타원 세포와 표현형에 있어서 많은 공통점이 있다. Telomerase는 telomere의 3''말단에 TTAGGG 반복 서열을 붙여 줌으로서 세포분열에 따른 telomere 길이 감소를 막아주는 기능을 하므로 세포 노화를 극복해 무한 분열을 하는 세포들에서 telomerase 활성은 중요하다. 선행 연구에서 LE/2,LE/6 와 WB-F344 세포의 telomerase 활성이 초반 계대에서 중반 계대까지 감소하다가 후반 계대로 진행됨에 따라 점진적으로 증가함을 알 수 있었다. 본 연구에서 이들 세포의 telomere 길이 변화를 측정해 본 결과, 계대를 거치는 동안 계속적인 telomere 길이 감소 현상을 보였고, 140 계대 이상을 거치는 동안 분명한 노화 형질을 보이지 않았다. Telomere 길이와 telomerase 활성의 상관관계를 보았을 때, 후반 계대의 세포에서 telomerase 활성이 증가함에 따라 telomere 길이 감소가 둔화되었으므로 이들 세포에서 telomerase는 telomere 길이 조절에 관여한다고 볼 수 있겠다. 짧은 telomere를 갖는 세포는 전리 방사선에 매우 민감하다고 알려져 있다. 따라서 랫 세포 내 짧은 길이의 telomere가 전리 방사선 조사에 대한 민감도를 증가시키는가를 알아보기 위해서 각기 다른 계대의 LE/2,LE/6 와 WB-F344 세포에 감마선을 조사하였다. 이들 세포의 각기 다른 계대에 있어서 감마선에 대한 민감도 차이는 볼 수 없었다. 최근에 유력한 telomerase 억제 물질로 밝혀진 PinX1의 특성을 알아보고자, WB-F344 세포주로부터 rPinX1을 클론하여 NIH/3T3 세포에 과발현시켜 공초점 현미경 관찰 결과 rPinX1이 핵인에 위치함을 보았고, rPinX1의 아미노 말단 서열을 절단한 형태인 rPinX1 ΔN은 핵과 세포질에 위치하고 있음을 보았다.

결론적으로, LE/2,LE/6 와 WB-F344 세포들의 telomere는 telomerase에 의해 조절되고, NIH/3T3 세포에서 일시적으로 과 발현된 rPinX1이 핵인에 위치했고, 이는 rPinX1의 세포 내 위치가 telomerase 활성 억제 기능에 영향을 미칠 가능성을 제시하고 있다.

[영문]Rat hepatic stem-like epithelial cells, LE/2, LE/6 and WB-F344, share a number of phenotypic properties with oval cells which are able to be observed in the early stages of hepatocarcinogenesis. Telomerase, a ribonucleoprotein complex, prevents telomeric shortening by adding TTAGGG repeats to the 3'' end of telomeres, therefore the activation of this enzyme is required for cells to overcome replicative senescence and obtain the ability to divide without limits. In the previous study, the telomerase activity of LE/2, LE/6 and WB-F344 cells declined from the early to intermediate passages, and progressively increased from the intermediate to late passages. At the late passages, the activity reached up to higher level than the initial level. To know the telomere maintainance of these telomerase positive cell lines, telomere length was measured during in vitro aging. These cells displayed no apparent aging phenotypes for over 140 passages, and telomere length of these cells progressively decreased with the passages. At the late passages, telomere shortening appeared to be reduced as telomerase activity increased. The relationship between telomere length and telomerase activity suggests that telomerase contributes to the regulation of telomere length in these cells. Short telomeres is known to result in hypersensitivity to ionizing radiation in mouse. To investigate whether shortened telomere of these rat epithelial cells is sensitive to ionizing radiation, -ray was irradiated to LE/2, LE/6 and WB-F344 cells in different passages. There was no significant difference of cellular sensitivity to -irradiation according to the different passages. This result suggests that the telomere length in these cells might not be critically shortened to induce chromosomal instability. Recently, PinX1 was identified from human and Saccharomyces cerevisiae as a potent telomerase inhibitor, however its function is not clearly understood. To confirm PinX1 localization in rodent, which has different features of telomerase and telomere length from human, PinX1 gene was cloned from WB-F344 cell line and then overexpressed in NIH/3T3 cells. Confocal microscopy showed that rPinX1 localized exclusively to the nucleolus, while rPinX1 N, N-terminus 257 amino acids deleted form, was found in the nucleus and the cytoplasm. Taken together, subsequent telomere shortening at the late passage was reduced by reactivated telomerase activity. And the subcellular localization of PinX1 may contribute to its function on telomerase inhibition.