The effect of cilostazol on the tissue factor expression in HUVECs and human monocytes

Abstract

[한글]

조직인자 (Tissue factor: TF )는 혈관벽 내에 존재하여 혈액응고 과정을 개시하는데 매우 중요하며, 혈관성형후의 혈전생성과 재협착에도 관여하는 것으로 알려져 있다. TF는 혈관내피세포뿐만 아니라 단핵구, 대식세포와 같은 고유면역세포에 발현하며, 특히 염증과 같은 병적인 환경에서는 TF발현이 현저히 증가하며 이로 인해 급성 관상동맥질환이나 혈관성형후의 재협착 등의 직접 원인이 된다. 그러므로 최근에 TF를 표적으로 이 인자의 발현을 제어하는 약물요법 등이 많은 관심을 끌며 개발되고 있다.

본 연구에서 사용한 cilostazol은 AMP-PDE 억제인자로서 항 혈전, 혈관확장, 심근수축등 순환기계 작용 등이 잘 알려져 있다. 임상적으로 널리 사용되나 순환기계 미치는 영향 중 특히 TF 발현과 관련 지어 cilostazol의 시험관 및 생체 실험 및 그 중요성에 대해서 논의된 보고는 전무하다. 이에 이의 연관성을 입증하는 기초연구로 HUVECS 와 monocyte에서의 TF 발현에 관한 cilostazol의 효과를 검증하고자 본 연구를 시도하였다.

인체 제대혈관내피세포(HUVECS: human umbilical endothelial cell) 과 단핵구 (Monocyte)을 건강한 성인으로부터 분리, 초벌배양(primary culture)을 한 후에 첫번째로 TF의 mRNA 발현을 보기위해서 PCR을 시행하였고 둘째로 TF 단백 발현을 규명하기 위해서 SDS-PAGE 법을 시행한 후에 TF, tubulin Ab를 이용하여 웨스턴 블롯법(Western blotting) 을 연속적으로 시행하였다. 첫번째 결과로 우선 HUVECS을 대상으로 TNF-로 자극시킨 세포에 각각 cilostazol의 농도를 달리하여 4시간 동안 배양, TF PCR을 시행한 결과 cilostazol의 농도에 비례하여 TF발현이 억제됨을 관찰할 수 있었다. LPS로 자극시킨 단핵구에서도 위의 제대혈 세포와 같은 양상을 보였다. 공히 두 세포에서 24시간 세포 배양 후 실시한 Western blot analysis를 통하여 TF protein을 확인한 결과 cilostazol의 농도에 비례하여 TF protein이 억제됨을 알 수 있었다.

결론적으로 cilostazol은 HUVECS와 monocyte에서 TF-mRNA와 TF protein의 발현을 억제하는 기전을 갖는 것으로 생각된다.

[영문]Tissue factor (TF) is a potent initiator of the coagulation cascade situated within the vessel wall as well as an important key sentinel in the pathogenesis of thrombosis and restenosis after balloon angioplasty. While TF is expressed not only on endothelial cell but also on innate immunocytes such as monocytes and macrophages, pathogenic environment culminates TF expression and release, leading to acute coronary syndrome or restenosis after balloon angioplasty. Recent basic studies focus on the therapeutic inhibition of tissue factor.

Cilostazol, even though it is classically known as AMP-PDE inhibitor, is clinically effective because of its possible antiplatelet, vasodilating, antimitogenic, and cardiotonic action. However, there were no known documents regarding usage or significance of cilostazol in direct relation with TF expression. To clarify this issue, we primarily examined the effect of the cilostazol on TF expression in TNF-α stimulated HUVECs and LPS-stimulated monocytes. HUVECs and CD14+ monocytes isolated from whole blood of healthy volunteers were incubated for 30minutes with or without cilostazol (1, 10, 100 μM). Thereafter, HUVECs were treated with TNF-α (10 ng/ml) and CD14 + monocytes with LPS (1 μg/ml), and incubated for 4 hours for RT-PCR or for 24 hours for Western blotting. As a result, expression of TF-mRNA and TF in TNF-α stimulated HUVECs was down regulated by cilostazol pretreatment in dose dependant manner. This down regulation in TF-mRNA and TF protein was similar in CD14+ monocytes.

In conclusion, these data indicate that cilostazol act as a TF inhibitor on HUVECs and monocytes by down regulating the TF-mRNA and TF protein expression.