Minocycline이 표피 각질형성세포의 증식과 고사에 미치는 영향

Abstract

[한글]

Tetracycline의 합성 유도체인 minocycline은 많은 피부 질환에서 유용하게 쓰이는 항생제로, 감염성 피부질환 이외에 여러가지 피부질환에서 광범위하게 치료 효과를 나타낸다. 임상적으로 사용되는 대표적인 피부질환으로는 여드름, 주사, 괴저성 농피증, 급성 두창상 태선양 비강진, 지속성 수장 족저 농피증, 유천포창, 융합성 망상 유두종증(confluent and reticulated papillomatosis) 등이 있다. Minocycline이 치료 효과를 나타내는 질병 중 융합성 망상 유두종증은 표피에서 유두종변화와 극세포증, 과각화증을 특징으로 하는 질환으로, 이 질병은 각질형성세포의 비정상적인 각질화 과정이 병인으로 여겨 지고 있다. 이와 같이 융합성 망상 유두종증에서 minocycline이 좋은 치료효과를 나타내므로, minocycline이 각질형성세포의 증식에 영향을 미칠 것이라는 가정을 하였다.

과거 본 연구실에서 시행한 연구결과에 의하면 minocycline은 각질형성세포의 증식과 분화를 억제하였다. 또한, minocycline이 각질형성세포의 세포간 부착을 저해하지만 세포간 부착에 중요한 단백인 desmoglein 발현에는 영향을 미치지 않았다. 하지만 minocycline이 어떤 기전으로 각질형성세포의 증식을 억제하는 지는 아직까지 밝혀진바 없다. 또한 minocycline이 각질형성세포의 고사를 유발하는지도 밝혀진바 없었기 때문에 본 연구자는 minocycline이 각질형성세포에서 고사를 유발한다는 가정 하에 이를 증명하기 위하여 실험을 진행 하였다.

Minocycline(10, 20, 30, 40, 50, 60 ㎍/㎖)을 각질형성세포에 투여 하였을 때 10 ㎍/㎖ 부터 세포고사가 유발 되었으며, 투여 농도에 비례하여 세포고사가 증가 하는 것이 확인 되었다. 세포주기 정지는 minocycline 투여 3시간 후부터 G0/G1 phase에서 발생하였으며, 50 ㎍/㎖ 투여하였을 때 대조군에 비하여 9% 의 G0/G1 phase 정지가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 minocycline을 투여한 각질형성세포에서 24시간 이후 세포고사가 발생한다는 것을 TUNEL염색을 통하여 확인 했고, FACS를 이용한 Annexin-V 와 PI 염색 실험에서 60 ㎍/㎖의 minocycline을 48시간 동안 투여했을 때 각질형성세포의 83% 에서 세포고사가 유발되었다. 또한, DNA content 분석에서 minocycline을 24시간 이상 투여했을 때 sub-G1 phase가 농도에 비례하여 증가하기 시작하여, 48시간 동안 60 ㎍/㎖ 투여 하였을 때 sub-G1 phase 의 DNA content가 66% 까지 증가 하였다. Minocycline에 의해 유도되는 세포고사는 고사신호전달 단백인 caspase-8 을 활성화 시켰으며, mitochondria 에서 cytochrome c를 유리시켜 caspase-3 의 활성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 minocycline에 의한 각질형성세포의 고사에는 extrinsic pathway와 intrinsic pathway가 모두 관여한다고 생각된다.

이상의 결과 minocycline은 투여 3시간 및 6시간 후에 G0/G1 phase 정지를 유발하여 각질형성세포의 증식을 억제 시키고, 24시간후 부터 caspase-8을 활성화 시키고 cytochrome c를 유리시킴으로서 각질형성세포의 세포고사를 유발한다는 것을 확인하였다.

[영문]Minocycline is one of the most widely used antibiotics in dermatology. In addition to the infectious conditions, it also has been used for the treatment of various noninfectious dermatological diseases, such as “acne, pustulosis palmaris and plantaris, bullous pemphigoid, and dystrophic epidermolysis bullosa”. Pharmacological mechanisms of minocycline in these diseases can be explained by its anti-inflammatory and immunosuppressive effects. Recently, minocycline has been proved to be effective for confluent and reticulated papillomatosis (CRP), which is characterized by hyperkeratosis, acanthosis and papillomatosis without any evidence of infection, inflammation and immune-dysfunction. Since the mechanism of action of minocycline for CRP cannot be explained by its known pharmacological effect, we examined the effect of minocycline on proliferation and apoptosis of the HaCaT cell. MTT assay showed that the proliferation of HaCaT cell was inhibited by minocycline. FACS analysis using propidium iodide staining and annexin-V staining showed that minocycline induce growth arrest at G0/G1 phase and minocycline also induce apoptosis in HaCaT cell. In addition, activation of caspase-8, caspase-3 and cytochrome c was detected in minocycline treated HaCaT cell by western blotting analysis. Therefore, apoptosis in HaCaT cell was triggered by minocycline, leading to activation of caspases via both extrinsic pathway and intrinsic pathway. These results suggested minocycline has an inhibitory effect on the proliferation of the keratinocyte and also induce apoptosis of the keratinocyte.