인간제대정맥내피세포에서 brazilein의 혈관신생 억제 효과

Abstract

[한글]

암치료 등에 이용할 수 있는 혈관신생 저해제를 탐색하던 중에 소목(Caesalpinia sappan)의 추출물이 혈관신생 억제에 효과가 있는 성분을 함유하고 있음을 발견하였으며, 소목에서 유래한 물질들에 대한 항암효과나 항혈관신생에 대한 연구가 보고된 바 없어 본 연구에서 소목을 연구의 소재로 선택하였다. 소목의 메탄올 추출물에서 혈관내피세포의 성장 및 맥관형성을 억제하는 활성부분을 크로마토그래피법과 재결정으로 순수하게 분리하여 분자량이 264인 brazilein임을 확인하고 본 실험에 사용하였다. Brazilein의 혈관신생 억제효과는 인간제대정맥내피세포 (Human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)에 대한 성장, 이동, 침윤, 관형성 및 MMP-2 생산 등에 대한 억제능력으로 평가하였다.

인간제대정맥내피세포에 3-5 ug/ml 정도의 brazilein을 처치하고 24 시간이 지난 후 관찰한 결과 세포가 위축되어 세포와 세포사이에 분리가 일어났으며, 48 시간 후에는 대부분의 세포가 심하게 위축되어 사멸하는 것을 관찰할 수 있었다. 혈관신생 과정에서 내피세포의 이동, 국부적인 침윤, 관형성 등은 혈관신생의 중요한 요소로 brazilein이 혈관신생에 필요한 다단계 과정에 미치는 영향을 in vitro 혈관신생 측정 방법들을 사용하여 조사한 결과 혈관내피세포의 성장, 이동, 침윤, 관형성 등을 효과적으로 억제하였다. Brazilein이 각종 세포성장인자들에 의하여 유도되는 혈관내피세포의 이동과 침윤을 억제하였으며, matrigel 상에서 혈관내피세포의 관형성을 저해하였다. MMPs 중에서 특히 MMP-2는 기저막을 분해하여 내피세포의 침윤을 촉진하는 등 혈관신생 과정에서 중요한 역할을 담당할 뿐 아니라 내피세포의 맥관형성이 MMP-2 활성에 의존적이라고 알려져 있다. 따라서 젤라틴 자이모그램 분석 방법을 이용하여 조사한 결과 혈관내피세포들이 분비하는 MMP-2의 분비가 brazilein 처치로 저하되었다. 이 결과는 brazilein이 나타내는 혈관내피세포의 침윤과 맥관형성 억제력이 어느 정도는 MMP-2 분비의 억제와 관련이 있을 것으로 판단된다. 혈관신생의 가장 중요한 단계 중의 하나는 내피세포의 성장으로 인간제대정맥내피세포에 대한 brazilein의 IC50는 2.3 ug/ml 정도로 낮은 농도에서 강력하게 혈관내피세포 성장을 억제하였다. Brazilein은 내피세포 성장을 억제하는 농도에서 세포독성을 나타내었고, 혈관내피세포에 brazilein을 처리하면 세포자연사에서 나타나는 전형적인 DNA 절편화가 관찰됨으로 brazilein에 의한 항혈관신생 효과는 혈관내피세포의 세포자연사 유도에 의한 효과가 중요한 요소임을 알 수 있었다.

결론적으로 소목에서 강력한 혈관신생 저해제인 brazilein을 분리하였으며, brazilein은 인간제대정맥세포의 이동, 침윤, 맥관형성, MMP-2의 생산 등을 억제하여 혈관신생 억제제로서의 가능성을 확인하였다.

[영문]It was found during screening program that methanol extract of Caesalpinia sappan heartwood showed anti-angiogenic activity. Anti-angiogenic or anti-tumor agents identified from Caesalpinia sappan were not known until now. Anti-angiogenic compound was isolated by extraction, chromatography and crystalization from methanol extract of Caesalpinia sappan. The compound was identified as a brazilein by the analysis of electrospray inonzation mass spectroscopy and H1-NMR spectroscopy.

In this experment, anti-angiogenic effects of brazilein on the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were investigated. After treatment with 5 ug/ml brazilein for 24 hours, HUVEC showed shrinkage and separation between cell and cell, and most of cells died after 48 hours. Angiogenic process was composed of proliferation, migration, invasion and tube formation of endothelial cells. Brazilein showed the inhibitory activities of these multiple process in vitro. Migration and invasion of HUVEC were inhibited by brazilein, and tube formation of HUVEC on the matrigel was inhibited by brazilein. Tube formation of vascular endothelial cells depends on MMP-2 activity, which enhances mobility and invasion. MMP-2 expression was completely repressed with 2ug

ml brazilein. Brazilein showed cytotoxic effect against HUVEC, and ,IC50 of brazilein against HUVEC is a 2.3 ug/ml. DNA fragmentation was examined as a characteristic of apoptosis. Brazilein induced the apoptosis of HUVEC, when HUVEC was treated with 5 ug/ml brazilein for 48 hours. Based on these results, it is suggested that brazilein is a potential angiogenesis inhibitor.