The effect of pamidronate on intervertebral disc and endplate

Abstract

[한글]

N-containing bisphosphonate는 파골세포의 세포 고사(apoptosis)를 유도하여 파골세포의 숫자를 감소하는 약제로 널리 알려져 왔다. bisphosphonate는 골 흡수를 억제하는 강력한 억제제로서, 폐경 후 생기는 골다공증, Paget 병, 골종양, 그리고 금속성 이식물를 사용하였을 때 발생하는 osteolysis 등의 파골세포 기능 항진으로 인한 경우에 널리 이용되고 있다. 또한 관절염에 있어서는 type 2 collagen의 분해를 억제하고, 부분적으로 연골을 보호하는 기능도 있음이 알려져 왔다. 척추 종판의 경화는 추간판으로의 영양 결손을 유발하며, 이는 추간판 퇴행의 원인이 된다. Bisphosphonate가 강한 골 흡수 억제능과 연골 보호능이 있다는 사실을 종합하였을 때, 이러한 약제의 골 흡수 억제능으로 인해 척추 종판의 비후가 유발될 수 있고 한편으로는 연골 보호능으로 인한 추간판의 연골세포 유사 표현형이 유지될 수 있으리라 예상된다. 따라서 본 연구에서는 시험관내에서 bisphosphonate가 추간판세포의 대사에 미치는 영향을 살펴보고, 조직학적으로 척추 종판과 추간판에 미치는 영향을 살펴보았다.

추간판 조직은 4명의 환자로부터 획득하였으며, 단계적 효소처리를 하였으며, 2세대bisphosphonate인 pamidronate의 영향을 시험관내에서 확인하고자, 추간판세포를 alginate bead를 이용한 삼차원 배양을 실시하였다. 삼차원 배양 중인 추간판 세포에 pamidronate의 농도가 10-9, 10-6, 10-3M이 되도록 각각 처리한 후, 세포 증식에 따른 DNA 합성을 알아보기 위해 [3H]-Thymidine incorporation을 실시하였고, 신생 proteoglycan 합성을 확인하고자 [35S]-Sulfate incorporation을 실시하였다. Collagen type 1, collagen type 2, 그리고 aggrecan유전자에 대한 mRNA 발현을 확인하고자 RT-PCR을 시행 하였다. 조직학적으로 pamidronate의 척추체에 미치는 영향을 확인하고자, 24마리의 C57 BL/6 mouse를 이용하여, pamidronate를 매주 정맥 주사하였으며, 실험군은 대조군, 저용량(30ug/kg), 고용량(90ug/kg)군으로 나누고, 투여 시작 후 5주와 12주에 각각 쥐를 희생하여 척추체를 획득하였다. 획득한 조직은 H&E 염색, Safranin-O 염색 그리고 TUNEL assay를 실시하였고, 형태계측학적 자료는 Image analyzing system을 이용하여 분석하였다.

시험관 내에서 pamidronate를 추간판세포에 농도별로 처리한 결과, 대조군과 비교하여 세포증식에 있어서 의미 있는 변화는 관찰되지 않았으나, 신생 proteoglycan의 합성은 대조군과 비교하여 저농도인 10-9M의 농도에서는 40%의 증가를 보였다. RT-PCR에 대한 densitometric assay에서는, 대조군과 비교해서 type 1 collagen, type 2 collagen 그리고 aggrecan의 mRNA 발현이 통계상으로 의미 있는 결과는 관찰되지 않았다. 12주 동안 매주 과용량의 pamidronate를 투여한 실험동물에서 종판의 두께는 증가하였으나, 대조군과 비교하여 5주와 12주째 저용량과 고용량 군에서의 수핵부의 괴사나 섬유륜부의 이상, 추간판 전체의 균열과 같은 특이한 변화는 없었다. TUNEL assay 결과에서도 고사된 세포에 대한 양성 반응은 관찰 할 수 없었다.

결론적으로, 제2세대 bisphosphonate인 pamidronate는 시험관 내에서 추간판세포에 대해서는 비교적 안전하며, 저용량 처리시에는 proteoglycan 합성이 촉진되었고, 세포표현형의 변화도 없음을 확인하였다. 실험동물에서도 pamidronate를 장기간 과용량 투여하였을 시 퇴행의 변화 없이 추간판 높이가 안정되게 유지되었다.

[영문]It has long been known that N-containing bisphosphonates (BPs) can reduce osteoclast number by inducing apoptotic cell death in osteoclasts. As potent inhibitors of bone resorption, they are widely used for the treatment of bone disorders that are due to increased osteoclast activity i.e. postmenopausal osteoporosis, Paget’s disease, tumoral bone disease, and particle induced osteolysis around metal implant. BPs also decrease breakdown of type II collagen and exhibit partial chondroprotective effect in a rabbit model of inflammatory arthritis. These findings support the fact that BPs have a chondroprotective effect. Nutritional deprivation caused by sclerosis of vertebral end plate provides, in part, a mechanism of intervertebral disc (IVD) degeneration. The fact that BPs have a powerful antiresorptive effect and chondroprotective effect prompts a research for the sum effect of BPs on IVDs since antiresorptive action can cause hypertrophy of endplate while chondroprotective effect can maintain chondrogenic phenotype of IVDs. Accordingly, the purposes of this experimental study were, firstly, demonstrate the effect of pamidronate, second generation N-containing BPs, on in vitro metabolism of IVD cells and secondly, the effect of pamidronate on histologic changes of endplate and IVD. Lumbar IVD tissues were obtained from four patients and digested and cultured in three dimensional alginate beads to validate in vitro effect of N-containing second generation pamidronate. Twenty-four mice (C57BL/6) were utilized to test in vivo effect of pamidronate. Various doses of pamidronate (10-9, 10-6, 10-3 M) were administered to human IVD cultures. 3H-Thymidine for DNA synthesis and 35S-Sulfate incorporation for proteoglycan synthesis were performed. Reverse transcription polymerase chain reaction for mRNA expression of collagen type I, collagen type II, and aggrecan was done. For in vivo test, high (90ug/kg) and low doses (30ug

kg) of pamidronate were injected intravenously to mice weekly for 5 weeks to 12 weeks. Treatment with normal saline served as control. Hematoxylin-Eosin stain, Safranin-O stain, and TUNEL assay were performed. Histomorphometric data were also collected. Human IVD cell culture in three dimensional alginate beads with various concentrations of pamidronate (10-9, 10-6, 10-3 M) showed no significant increase in DNA synthesis compared to control culture. Human IVD cell showed significant increase in proteoglycan synthesis, 40% increase with a dose of 10-9 M pamidronate (p<0.05), compared to control culture. In densitometric assay of reverse transcription-polymerase chain reaction, human IVD cell cultures showed no statistically significant changes in mRNA expression of type I collagen, type II collagen, and aggrecan compared to control. There was significant increase in thickness of endplate in animal with high dose pamidronate for 12 weeks after weekly injection. Moreover, there were no significant changes in nucleus and annulus such as necrosis and hyalinization of nucleus, disturbance of circular pattern of annulus, and cleft in nucleus and annulus in low dose and high dose group and in 5 weeks and 12 weeks follow up group, compared to control animals. There was no significant increase in TUNEL positive cells in endplate, nucleus, and annulus of IVD in experimental group compared to control.

In conclusion, pamidronate, N-containing second generation BPs, was safe in vitro metabolism of IVD and stimulated proteoglycan synthesis in low dose, and maintained chondrogenic phenotype. Also long term high dose treatment of pamidronate was also safe to IVD maintaining disc height without evidence of degeneration.