만성 B형 활동성 간염에서 B형 간염 바이러스의 precore 돌연변이와 간내 HBcAg의 발현양상

Abstract

[한글]

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)에 의한 만성 간염의 자연경과중 활동기에는 바이러스의 증식이 활발하고 혈청내에서 HBeAg이 검출되며, 비활동성기에는 혈청 transaminase치가 정상이거나 경미하게 상승하고 바이러스의 증식은 종식되며 HBV-DNA는 숙주의 genome내로 삽입되고 혈청내에서는 antiHBe가 검출되는 것으로 알려져 있다. 만성 B형 간염의 이러한 전형적인 경과는 대부분 야생형 HBV에 감염된 환자에서 발견되지만, 일부 antiHBe가 양성인 환자들에서도 혈청 transaminase의 증가가 심하고, 혈청 HBV-DNA가 검출되는 비전형적인 예들이 보고되고 있다. 한편 HBV genome에 대한 분자생물학적 연구에서는 HBV-DNA의 precore 부위에 돌연변이가 있음이 발견되었고, 가장 흔한 변이는 1896번 염기가 guanine에서 adenine(G→A)으로 치환되어 tryptophan이 정지 codon을 형성하는

것으로 알려졌으며, 이러한 HBeAg 결손을 일으키는 변이형 HBV가 소위 antiHBe 양성 만성 간염의 원인으로 지적되었다. 변이형 HBV는 전격성 간염 환자에서도 발견되어 precore 변이형이 심한 간질환을 유발할 것으로 생각되었으나, 무증상 HBV 보유자에서도 발견되어 precore 변이형의 병인적 역할은 아직 확실하지 않다.

본 연구에서는 혈청 HBsAg 양성이고 조직학적으로 만성 활동성 간염(chronic active hepatitis, CAH)인 30예를 대상으로 하여 혈청 HBeAg 양성군(11예)과 음성군(19예)으로 나누고, 음성군을 다시 alanine transaminase(ALT)치가 비정상인 군(11예)(급성악화의 임상

상으로 내원하였거나 ALT치가 6개월 이상 변동을 보인 경우)과 ALT치가 정상인 군(8예)(내원시및 6개월 이상 ALT치가 정상이거나 정상 상한치의 2배 미만인 경우)으로 나눈 다음 혈청H8V-DNA 검출율, direct sequencing과 primer extension assay를 통한 precore 변이

의 종류 및 출현빈도, 간내 HBcAg의 발현양상을 각 군간 상호 비교함으로써 HBV-CAH에서 precore 변이의 구체적 의의를 밝히고자 하였다.

혈청 HBV-ONA 검출율은 HBeAg 양성군에서 가장 높았고, HBeAg 음성이면서 ALT 정상인 군에서 가장 낮은 경향을 보였다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 precore 부위 HBV-DNA 검출은 HBeAg 양성군에서는 100%였으며, HBeAg 음성군에서는 84.2%였다. PCR 산물에 대한 direct sequencing 결과, precore 변이는 총 20예에서 1896번 염기의 G→A 변이가 검출되었으며, 그 중 1예에서 1846번 염기의 conserved 변이(A-→T)가 동반되어 있었다. Direct sequencing에 의한 1896번 변이형의 검출율은 HBeAg양성군에서는 63.6%, HBeAg 음성 ALT 비정상군에서는 80.0%, HBeAg 음성 ALT 정상군에서는 83.3%이었으나, primer extension assay에 의한 경우에는 각각 90.9%, 100% 및 100%였다. Pri

mer extension assay에 의해 1896번 변이형이 검출된 예들의 대부분(21/27)은 야생형과의 혼합감염이었다. 간내 HBcAg은 핵보다는 세포질에서 더 자주 발현되었으며, 이러한 HBcAg의 발현에 있어서 혈청 HBeAg의 상태, ALT치, Precore 변이형 감염 유무에 따른 차이는

없었다. 그러나 혈청 HBV-DNA 양성인 경우에는 세포질 HBcAg 발현이 흔한 경향이었고, Precore 변이형 단독감염이나 변이형 우세 혼합감염이 많은 경향을 보였다.

이상의 결과를 종합하면 우리나라의 B형 CAH 예들에서는 혈청 HBeAg 상태 및 ALT치와 관계없이 대부분 precore 1896번 변이형과 야생형 HBV가 혼합감염되어 있음을 알 수 있다. 또한 혈청 HBeAg 음성인 경우 변이형 단독감염 또는 변이형 우세 혼합감염이 많지만, HBeAg 양성인 경우에도 변이형 감염이 적지 않은 것으로 보아 CAH 경과중에 야생형이 숙주면역반응에 저항성을 갖는 변이형으로 점차 대체되어 가는 것으로 생각된다. 반면에 혈청 HBV-DNA가 양성인 경우에 변이형 단독감염 또는 변이형 우세 혼합감염이 많은 것은 변이형이 면역제거시기에 보다 활발히 증식함을 시사한다. 본 연구에서 적용한 primer extension assay는 precore 변이형 검출에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]

In chronic hepatitis B, active disease is usually associated with ongoing viral replication and the release of HBeAg of hepatitis B virus(HBV) into the serum. The inactive phase of the hepatitis is characterized by normal or only slightly elevated transaminases in the absence of viral replication and the occurrence of antiHBe in the serum. These principal patterns of chronic hepatitis B are found in the vast majority of individuals infected with the wild type HBV. However, a subgroup of patients were described with a severe course of chronic hepatitis B with antiHBe and HBV-DNA in the serum. Molecular analysis of HBV genome consistently showed changes in the base sequence of the precore gene of HBV-DNA and provided strong evidence that an HBeAg negative precore mutant HBV is responsible for this type of antiHBe positive chronic hepatitis. These mutations also have been detected in patients with fulminant hepatitis B, suggesting that the precore mutant HBV may cause severe liver disease. However, some studies have shown that this mutant can also be detected in asymptomatic HBV carriers. Thus, the roles of precore mutant HBV in the pathogenesis of chronic hepatitis B are not clear yet.

The aim of this study was to clarify the roles of the precore mutant HBV in the pathogenesis of chronic active hepatitis B(CAH-B ). Eleven biopsy-proven CAH-B patients with HBeAg(-) and abnormal serum alanine transaminase(ALT) levels, 8 CAH-B

patients with HBeAg(-) and normal serum ALT levels, and 11 CAH-B patients with HBeAg(+) were included. Using the stored serums obtained at the time of the liver biopsy, serum HBV-DNA quantitation assay, direct sequencing of the amplified precore region HBV-DNA, and primer extension assay designed for detecting 1896 precore mutant and defining the HBV populations of wild type and 1896 precore mutant were performed. Expression pattern of intrahepatic HBcAg was investigated by using immunohistochemical staining.

The results obtained were as follows:

1. The detection rate of serum HBV-DNA was highest in HBeAg(+) CAH-B patients and lowest in HBeAg(-) CAH-B patients with normal serum ALT, although there was no statistical significance.

2. The detection rate of the precore region HBV-DNA by polymerase chain reaction was 100% in HBeAg(+) CAH-B patients and 84.2% in HBeAg(-) CAH-B patients.

3. Direct sequencing of the enzymatically amplified precore HBV-DNA revealed that precore mutations were, if any, G→A Point mutation at the nucleotide 1896 resulting in the stop codon. Conserved mutation of A→T at the nucleotide 1846 was found in one patient who simultaneously had 1896 mutation.

4. The prevalence of 1896 precore mutant determined by direct sequencing was 63.6% in HBeAg(+) CAH-B patients, 80.0% in HBeAg(-) CAH-B patients with abnormal serum ALT, and 83.3% in HBeAg(-) CAH-B patients with normal ALT.

5. The prevalence of 1896 precore mutant determined by primer extension assay was 90.9% in HBeAg(+) CAH-B patients and 100% in HBeAg(-) CAH-B patients with both abnormal and normal serum ALT. Contrary to the results of direct sequencing, mixed infection was proved to be most prevalent by primer extension assay.

6. Immunohistochemical stain revealed that cytoplasmic HBcAg expression seemed to be more common than nuclear HBcAg regardless of the status of serum HBeAg and serum ALT levels. No difference was found in expression pattern of intrahepatic HBcAg according to the types of HBV population.

7. Cytoplasmic HBcAg seemed to be more commonly expressed when serum HBV-DNA was detectable by a quantitation method in both HBeAg(+) and HBeAg(-) CAH-B patients. Also mutant only and mutant predominant mixed infections seemed to be more Prevalent when serum HBV-DNA was positive in both HBeAg(+) and HBeAg(-) CAH-B

patients.

These results indicated that 1896 precore mutant HBV was most prevalent and present in a state of mixed infection in Korean CAH-B patients irrespective of serum HBeAg and ALT status. An observation that mutant only and mutant predominant mixed infections tended to be more prevalent in HBeAg(-) CAH-B patients than in HBeAg(-) CAH-B patients suggests that 1896 precore mutant would be positively selected by the host immune response and gradually replace wild type. In contrast, there was a tendency that mutant only and mutant predominant mixed infections were

more frequent when serum HBV-DNA was detectable by a quantitation method and this finding suggests that 1896 precore mutant could replicate more actively in the immunoelimination phase than wild type. Primer extension assay seems to be useful for the detection of 1896 precore mutant and allows to define the HBV populations of wild type and 1896