Immunomagnetic bead 및 avidin-biotin column을 이용한 CD34+ 조혈간세포 분리

Abstract

[한글]

CD34 세포표면항원(MY10, HPCA-1)은 조혈간세포에 선택적으로 표현되며 세포가 분화성숙단계를 거치면서 소실되어 CD34+ 세포는 클른형성 조혈모세포의 특성을 갖는 세포로 추론되고 있으며, 임상 골수이식측면뿐만 아니라 조혈모세포의 성상에 대한 기초연구 및 유

전자치료의 유전자 매개체로서 가장 이상적인 세포군으로 알려져있다. 이에 저자는 정상인 9예의 골수 및 급성골수성백혈병환자 13예의 초진시 골수를 이용하여 immunomagnetic bead와 avidin-biotin column의 두가지 방법으로 CD34+ 세포를 분리, 그 결과를 비교 검

토함으로써 CD34+ 세포분리의 순수도 및 효율을 높일 수 있는 효과적인 분리법을 밝혀내고자 하였다.

1. Immunomagnetic bead를 이용하여 정상인 5예의 골수와 급성골수성백혈병 10예의 초진시 골수를 대상으로 CD34+ 세포를 분리하였는데 정상인과 급성골수성백혈병환자의 골수에서 CD34+ 세포 빈도는 각각 73.4 ± 12.4 %, 82.9 ± 6.3 %로 차이가 없었으며, 분리후 세포빈도의 증가 배율은 각각 41.9 ±12.5 배, 10.3 ± 7.5 배로 분리전의 CD34+ 세포 빈도가 낮았던 정상인 골수에서 높았고(p 0.05), 재생율은 각각 59.1 ± 11.8 %, 41.2 ± 9.3 %로 차이가 없었다.

2. Immunomagnetic bead로 CD34+ 세포분리후 전 15 예의 CD34+ 세포의 빈도(purity)는 79.8 ± 5.7 % 이었고, 분리후의 증가 배율(enrichment)은 20.0 ± 7.4 배이었으며 재생율(yield)은 47.2 ± 7.4 % 이었다.

3. Avidin-biotin column을 이용하여 정상인 4예의 골수와 급성골수성백혈병 3예의 초진시 골수를 대상으로 CD34+세포를 분리하였는데 정상인과 급성골수성백혈병환자의 골수에서 CD34+ 세포 빈도는 각각 55.6 ± 10.2 %, 89.3 ± 3.9 %로 백혈병환자의 골수에서

높은 경향을 보였으며, 분리후 세포빈도의 증가 배율은 각각 64.2 ± 28.9 배, 3.0 ± 1.4 배로 분리전의 CD34+ 세포 빈도가 낮았던 정상인 골수에서 높은 경향을 보였고, 재생율은 각각 19.6 ± 8.8 %, 10.7 ± 4.0 %로 차이가 없었다.

4. Avidin-biotin column으로 CD34+ 세포분리후 전 7예의 분리후 CD34+ 세포의 빈도(purity)는 70.3 ± 8.9 % 이었고, 분리후의 증가 배율(enrichment)은 38.0 ± 19.8 배이었으며 재생율(yield)은 15.8 ± 5.3 % 이었다.

5. Immunomagnetic bead와 avidin-biotin column의 CD34+ 세포분리 결과를 비교하면 정상 골수에서는 분리후 CD34+ 세포의 빈도는 immunomagnetic bead에서 73.4 ± 12.4 %로 avidin-biotin column의 55.6 ± 10.2%에 비해 높은 경향을 보였으나 유의한 차이는 없었으며, 재생율은 immunomagnetic bead의 경우 59.1 ± 11.8 %로 avidin-biotin column의 19.6 ± 8.8 %보다 유의하게 높았다(p=0.05).

6. 급성골수성백혈병 환자 골수의 경우 immunomagnetic bead와 avidin-biotin column에서 CD34+ 세포의 빈도 및 분리후 배율, 재생율에서 모두 유의한 차이는 없었으나 재생율은 immunomagnetic bead의 경우 41.2 ± 9.3%로 avidin-biotin column의 10.7 ± 4.0% 보

다 높은 경향을 보였다.

7. 전체 표본에서 CD34+ 세포의 분리 후 빈도 및 배율의 증가는 immunomagnetic bead와 avidin-biotin column에서 유의한 차이가 없었으나, 재생율은 immunomagnetic bead와 avidin-biotin column에서 각각 47.2 ± 7.4%와 15.8 ± 5.3%로 immunomagnetic bead에서

유의하게 높았다(p=0.02).

이상의 결과로 immunomagnetic bead 방법은 목적세포의 유실이 적으면서 높은 C034+ 세포의 빈도를 얻을 수 있는 효과적인 세포분리법으로 생각되며, 추후 임상적용 여부에 대한 연구검토가 필요하겠다.

[영문]

CD34 cell surface antigen(MY10, HPCA-1) is expressed selectively on the hematopoietic stem cells and disappears as the cells are on going differentiation and maturation and CD34+ cells are supposed to have the characteristics of clonogenic hematopoietic progenitors. CD34+ cells would be an ideal population for

clinical transplantation as well as for basic research on stem cells and offer an advantage for current clinical gene transfer methodology. In this study, CD34+ cells were separated from the borne marrows of 9 normal persons and 13 patients with acute myelogenous leukemia on diagnosis by immunomagnetic bead method and avidin-biotin immunoadsorption column method and efficacy of the two separation methods were assesed to provide far more effective separation method.

1. CD34+ cells were separated from bone marrows of 5 normal persons and 10 patients with acute myelogenous leukemia on diagnosis by immunomagnetic bead and after separation, CD34+ cell purify of AML marrow had a higher tendency compared with that of normal marrow, as 82.9±6.3%, 73.4±12.4%, respectively, and

enrichment of CD34+ cell of normal marrow, which had lower preseparation purity, was 41.9±12.5X, significantly higher than AML marrow's 10.3±7.5X(p O.05) and yields of normal and AML marrow were comparable, as 59.1±11.8% and 41.2±9.3%, respectively.

2. Total 15 sample's Purity, enrichment and yield of CD34+ cells after separation by immnunomagnetic bead were 79.8±5.7%, 20.0±7.4X and 47.2±7.4%, respectively.

3. CD34+ cells were separated from bone marrows of 4 normal persons and 3 patients with acute myelogenous leukemia on diagnosis by avidin-biotin column and after separation, CD34+ cell purity of AML marrow had a higher tendency compared with that of normal marrow, as 89.3±3.9%, 55.6±10.2%, respectively, and enrichment of CD34+ cell of normal marrow, which had lower preseparation purity, was 64.2±28.9X, significantly higher than AML marrow's 3.0±1.4X, and yields of normal and AML marrow were comparable, as 19.6±8.8 and 10.7±4.0%, respectively.

4. Total 7 sample's purity, enrichment and yield of CD34+ cells after separation by avidin-biotin column were 70.3±8.9%, 38.0±19.8X and 15.8±5.3%, respectively.

5. In normal marrow, CD34+ cell purity of immunomagnetic bead had a higher tendency compared with that of avidin-biotin column, as 73.4±12.4% and 55.6±10.2%, respectively, but yield of immunomagnetic bead was significantly higher than that of avidin-biotin column(47.2±7.4% and 17.8±5.8%, respectively).

6. In AML marrow, purity and enrichment of CD34+ cell were comparable between immunomagnetic bead and avidin-biotin column but yield of immunomagnetic bead had a higher tendency compared with that of avidin-biotin column(41.2±9.3% and 10.7±4.0%, respectively).

7. Overall purity and enrichment of CD34+ cell were comparable between immunomagnetic bead and avidin-biotin column, but yield of immunomagnetic bead was significantly higher than that of avidin-biotin column(47.2±7.4% and 15.8±5.3%, respectively).

In conclusion, immunomagnetic bead method was effective CD34+ cell separation method with high CD34+ cell purity and less target cell loss. Further evaluation for clinical application of CD34+ cell separation may be warranted.