핵소체 인단백 B23과 그 유사 단백의 특성

Abstract

[한글]

핵소체 단백 B23은 핵소체 내 가장 많이 존재하는 단백으로 그 기능은 아직 밝혀져 있지 않으나 여러 실험을 통하여 ribonucleoprotein 대사, 핵과 세포질 간의 연관관계, 바이러스 복제등과 같은 다양한 기능을 가졌을 것이라 추측하고 있다. 본 연구에서는 이러한 B23 단백의 기능을 밝혀나갈 목적으로 발암제이면서 핵소체 비대를 초래하는 thioacetamide를 투여하여 핵소체 내 단백의 변화를 관찰하였다. Thioacetamide에 의한 핵소체 내 단백 변화는 B23 단백의 증가와 함께 45kDa 단백(p45)의 출현을 관찰하게 되었다. 이러한 p45를 B23 단백의 전구체로 가정하여 핵소체와 세포내 분획을 통하여 존재 위치를 관찰하고 구조적 유사성을 연구하였다. 실험재료로는 흰쥐(Sprague-Dawley계)의 간장을 사용하였으며, sucrose method에 따라 핵과 핵소체를 분리하여 단백을 추출하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)와 western blot으로 B23 단백의 변화를 관찰하였고 세포 분획을 시행하여 B23 단일클론 항체에 염색되는 단백의 세포내 분포를 분석하였다. 마이크로솜 분획을 세분화하여 B23 유사단백의 분포를 관찰하였으며 젤 여과 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피로써 B23 유사단백을 순수 분리한 후, tryptic peptide mapping을 시행하여 B23 유사단백의 구조를 분석하였다.

얻은 결과는 다음과 같다.

1. Thioacetamide에 의한 핵소체 내 단백 변화는 B23 단백이 증가하였고, 정상상태에서 볼 수 없었던 45kDa 단백(p45)을 인지하였다.

2. 세포분획상 B23 단일클론 항체에 면역염색되는 분획은 핵소체 분획, 핵질 분획 그리고 마이크로솜 분획이었다.

3. 마이크로솜의 세분화된 각 충에서 B23 단일클론 항체에 면역염색 되는 것은 2M sucrose충이었다.

4. 2M sucrose충의 단백을 순수분리하여 Sephacryl S-200 젤 여과 크로마토그래피를 시행한 결과 모든 단백은 native condition에서 200kDa 이상의 분자량으로 존재하고 있으며,SDS로 denaturation시키면 80kDa으로 검출되었다.

5. 2M sucrose충의 단백을 phosphecellulose 이온교환 크로마토그래피로 분리한 결과 B23 단일를론 항체로 면역염색되는 단백은 80kDa(p80), 65kDa(p65), 60kDa(p60)으로 나타났다.

6. Tryptic peptide mapping에 의한 각 단백의 펩타이드 수는 B23 단백이 14개, p8o이 21개, p65가 13개, p60이 18개로 관찰되었으며, B23과 p80은 9개의 공통 펩타이드를 소유하고 있으며, p60의 18개 펩타이드 모두는 p80과 공유되어 있었다.

이상의 실험결과로 보아 p45가 B23단백의 직접적인 전구체라고 할 수는 없지만, B23 단백의 전구체는 200kDa 이상의 고분자로서 존재한다고 추측할 수 있으며, p80과 B23 단백의 공통 펩타이드는 9개인 것으로 보아 이 고분자에서 p80과 B23 단백이 각각 파생되어

나온 것으로 분석할 수 있었다. 또한 p60의 모든 펩타이드는 p80의 펩타이드에 속하므로 p80에서 파생된 단백임을 알 수 있었다.

[영문]

Protein B23 is one of the major nucleolar phosphoproteins associated with pre-ribosomal particles, and is localized in the granular region of the nucleolus.

Recent studies suggest that protein B23 shuttles between nucleus and cytoplasm and also interacts with HIV Rev. These findings indicate that protein B23 is important in nucleocytoplasmic relationship and viral replication. However, the exact function of protein B23 is not clear yet.

In acute nucleolar hypertrophy of rat liver, treated with thioacetamide, there was observed an increase of not only protein B23 but also B23-like protein p45 when anti-B23 monoclonal antibody(MAb) was used for identification. On the basis of the

large B23 specific epitope structure composes of 68 amino acids, a hypothesis was formulated to examine that p45 is the pre-B23 resulting from excessive production of B23. In an attempt to investigate the Precursor of B23, we analysed the subcellular fractions and microsomal subfractions. Subsequently, we analysed the finger printings of B23-like proteins using the tryptic Peptide mapping.

The results are summarized:

1. Using B23 MAb, we observed the presence of B23-like proteins in nucleolar fraction, nucleoplasmic fraction and microsomal fraction.

2. In the further microsomal subfractionation, we could partially purify B23-like protein in 2 M layer of sucrose gradient.

3. The 2 M sucrose fraction shows high molecular weight protein(MW>200kDa) on the basis of gel filtration chromatography in native condition, but the denaturation with hot SDS resulted in smaller molecular weight proteins 80 kDa(p87).

4. When ion exchange chromatography was employed, there were protein species other than 80 kDa(p80), 65 kDa(p65) and 60 kDa(p6O).

5. Based on the tryptic map analysis of ^^1251 labeled proteins, the similarity between B23 and p80 was found only in 9 out of 14(B23) and 21 (P8()) Peptides, and difference was fecund in the remaining peptides. p80 and p60 had 18 common peptides, and all the peptides of p6O were similar to those of p8O.

From these results, it is proposed that there may be a high molecular weight precursor protein of B23 where p87, p45 and B23 are derived. However, there is no sufficient finding to support that p45 is the direct precursor of B23.