B 림프구에서 모발상세포(hairy cell)로의 형질전환에 Coxiella bumetii와 Epstein-Barr 바이러스의 역할

Abstract

[한글]본 실험은 모발상세포주(Hairy cell line)에서 Coxiella bumetii와 Epstein-Barr바이러스(EBV)의 활성 여부를 규명하여 모발상세포변형에서 두 인자의 역할을 규명하고자 하였다. 모발상세포란 모발상세포 백혈병이라는 B 세포 유래 림프증식성 질환의 특징적 세포이다. 모발상세포 백혈병의 병리학적 특징은 잘 밝혀져 있으나 그 병인 즉 모발상세포의 형질전환 인자는 밝혀진 바 없다. 근래 본 교실에서는 C. burnetii에의한 B 세포의 모발 상세포변형을 보고하였고, 여러 모발상세포주를 확립 계대배양하고 있다. 이들 세포주의 세포는 모두 B 세포이고, in vitro계대가 지속되는 영속화세포이다. 지금까지 C. burnetii가 인간을 포함한 동물의 B 세포는 물론 기타 어느 세포의 암세포 변형에 연관된다는 사

실은 없었다. 이에 반하여 EBV는 인간 B 세포를 형질전환시킬 수 있는 바이러스로, B 세포 유래 모발상세포 백혈병의 관련 인자 중의 하나로 생각되어 왔다. 그러나 EBV는 대부분의 정상 성인 B 세포에 불현감염되어 있어, 모발상세포에서 발견되는 EBV가 B 세포의

모발상세포로의 형질전환 과정에서 원인인자로의 단독작용 가능성은 불명확한 상태이다.

본 실험에서는 확립된 모발상세포주에서 C. burnetii 특이 superoxide dismutase유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 증폭시켜 C.bumetii의 지속적인 세포내 존재를 확인하였다. EBV의 활성화는, B 세포 형질전환에 꼭 필요하고 형질전환된

B 세포에서만 발현되는, EBNA2유전자의 발현을 검사하였다. EBNA2유전자의 mRNA전사가 일어남은 역전사 중합효소연쇄반응 (RT/PCR)으로 검사했고, EBNA2항원 발현은 간접 면역형광 염색법을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. C. burnetii 특이 superoxide dismutase유전자의 PCR을 시행하여 257bp의 DNA 단편의 증폭을 확인하였다. 증폭된 DNA에 restriction fragment length polymorphism(RFLP)을 시행하여 C. burnetii의 DNA 단편과 동일한 DNA임을 검증하여, 본 실험에 사용된 모든 모발상세포주에서 C. burnetii가 지속적으로 존재함을 증명하였다.

2.모발상세포주에서 EBNA2유전자의 mRNA 전사가 일어남을 RT/PCR로 검출했고, 증폭된 cDNA에 RFLP를 시행하여 EBNA2의 161bp의 DNA 단편과 동일한 DNA임을 검증했다. 이는 모발상세포에서 EBNA2유전자가 활성화되어 있다는 사실을 증명하였다.

3. 모든 모발상세포 세포주에서 EBNA2 유전자 발현의 최종산물인 EBNA2 항원단백을 특이 단세포항체(PE2)를 이용한 간접 면역형광 염색법으로 모발상세포 핵내에 발현되어 있음을 확인하였다.

이상의 결과 본 실험에 사용된 모든 모발상세포주에서 C. burnetii가 지속적으로 존재함을 확인하였고, 또한 모든 세포주에서 EBNA2 유전자가 활성화되어 transcript가 존재하고 이의 항원단백이 발현되는 것을 확인했다. 이는 B 세포의 모발상세포로의 형질전환에

서 C. burnetii의 감염과 EBV의 활성화가 관여함을 의미한다고 생각한다.

[영문]Hairy cell leukemia is a chronic lymphoproliferative malignancy of B cell lineage and it is not easy to cultivate or establish this leukemic cell due in part to the mature nature. Several Hairy cell lines were established f개m the peripheral blood mononuclear cells from patients infected with the Coxiella burnetii. Since Epstein-Barr virus(E8V) has known to cause latent infection in B cells and immortalize the cells in vitro, it was suggested that latent infection of EBV in B cells may play a role in the pathogenesis of Hairy cell transformation in vitro. It

was suspected that latency of EBV is activated by C. burnetii in Hairy cell transformation .

To determine the persistency of C. burnetii in Hairy cells, 257bp DNA fragment of C. burnetii specific superoxide dismutase gene was amplified by employing polymerase chain reaction in Hairy cells. To clarify the role of EBV in neoplastic transformation of Hairy cell, activation of Epstein-Barr virus nuclear antigen2(EBNA2) gene, which has been known to be the most important in immortalizing B cells, was determined by detection of EBNA2 transcript by using reverse transcription and polymerase chain reaction(RT/PCR) in Hairy cells. Along with the mRNA RT/PCR, immunofluorescence assay far the EBNA2, which localize to

non-nucleolar, large, subnuclear, and granule, was performed for determining the antigen expression.

The main results of the experiments are summerized as follows:

1. All of the Hairy cell lines tested were positive for C. burnetii by PCR.

2. All of the Hairy cell lines tested were positive for EBNA2 by RT/PCR.

3. PCR amplified gene products of C.burnetii and EBNA2 were confirmed by restriction fragment length polymorphisme(RFLP).

4. Expression of EBNA2 in Hairy cells were detected by indirect

immunofluorescence assay(IFA). All of the Hairy cell lines tested were positive for EBNA2 by IFA.

From this study, it might be suggested that C.burnetii is persistent and EBNA2 gene is actively transcribed in Hairy cell lines. It seems that C.burnetii and activation of latent infection of Epstein-Barr virus in B cells is participated in

Hairy cell transformation. Therefore it is necessary to identify the relationship of C.burnetii and latency of Epstein-Barr virus in Hairy cell transformation of B cells.