Elucidating the Downstream Position and Functional Role of SFK Activation After CagA Phosphorylation in Helicobacter pylori Infection

Abstract

Helicobacter pylori is a gastric pathogen closely associated with various gastric diseases. Its key virulence factor, the oncoprotein CagA, is delivered into gastric epithelial cells via a type IV secretion system, where it undergoes tyrosine phosphorylation and triggers signaling pathways that induce cell elongation ("hummingbird phenotype"). While Src family kinases (SFKs) have been identified as the main kinases mediating CagA phosphorylation, this study re-evaluates their role by examining the interplay between CagA phosphorylation, SFK activation, and downstream cellular effects. The Helicobacter pylori strain G27, as well as AGS and MKN28 gastric cancer cell lines were used to conduct the study. Our findings revealed that SFK activation was entirely inhibited at 0.5 μM PP2 without significantly affecting CagA phosphorylation, cell elongation, or IL-8 induction, indicating that SFK is not essential for these processes. At higher PP2 concentrations, both CagA phosphorylation and cell elongation were reduced in a dose-dependent manner. Immunofluorescence and FACS analyses revealed that PP2 treatment decreased H. pylori binding to AGS cells, potentially accounting for the observed effects. Infections with ∆cagA and phosphorylation-resistant cagA-EPISA strains failed to activate SFK, suggesting that SFK activation occurs downstream of CagA phosphorylation. We demonstrated that H. pylori-mediated SFK activation is regulated via the Shp2-Raf-Mek-Erk pathway by employing specific siRNA and inhibitors. SFK inhibition did not impact ERK activation and IL-8 induction. However, wound healing and transwell invasion assays demonstrated that SFK inhibition significantly impairs H. pylori-induced wound healing and cell invasion, underscoring a specific role for SFK in modulating host cell motility during infection. Our study propose that SFK activation occurs downstream of CagA phosphorylation, potentially via ERK pathway activation. This suggests that alternative kinases may be responsible for CagA phosphorylation, offering new insights into the molecular mechanisms of Helicobacter pylori pathogenesis. Although SFK was dispensable for CagA phosphorylation, cell elongation, ERK activation, and IL-8 induction, it governed the migratory and invasive responses induced by H. pylori. These findings highlight a previously under-recognized but essential function of SFK in regulating host cell motility during infection.

Helicobacter pylori 는 위암과 소화성 궤양의 발생과 밀접하게 관련된 위장 병원균이다. 이 균의 주요 병원성 인자 중 하나인 종양단백질 CagA 는 제 4 형 분비 체계을 통해 위 상피세포 내로 주입되며, 세포 내에서 티로신 인산화 과정을 거쳐 다양한 세포 신호 전달 경로를 활성화시키고 세포신장 (Humminbird phenotype) 을 유도한다. CagA 인산화에 관여하는 주요 인산화효소로 Src 계열 인산화효소(SFK)가 알려져 있으나, 본 연구에서는 CagA 인산화, SFK 활성화, 그리고 이로 인한 세포 반응 간의 연관성을 재평가하였다. SFK 가 CagA 인산화 및 H. pylori-매개 세포 신장에 어떤 역할을 하는지를 분석하기 위해 SFK 억제제인 PP2 를 이용하였다. SFK 활성화 및 CagA 인산화 여부는 immunoblotting 을 통해 분석하였고, 세포 신장 여부는 현미경 관찰을 통해 평가하였다. 또한, H. pylori 의 AGS 세포 부착 능력은 Immunofluorescence assay 과 FACS 분석을 통해 측정하였다. SFK 활성화와 CagA 인산화 간의 관계를 명확히 하기 위해, cagA 유전자 결손 균주(∆cagA) 및 인산화 저항성 cagA 돌연변이 균주(cagA-EPISA) 감염도 함께 수행하였다. 연구 결과, 0.5 μM 농도의 PP2 처리 시 SFK 활성화는 완전히 억제되었으나, CagA 인산화, 세포 신장, IL-8 생성에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이는 SFK 가 이러한 과정에 필수적이지 않음을 시사한다. 그러나 PP2 농도가 증가함에 따라 CagA 인산화 및 세포 신장은 농도 의존적으로 감소하였다. Immunofluorescence assay 및 FACS 분석 결과, PP2 처리로 인해 H. pylori 의 AGS 세포 부착 능력이 감소한 것으로 나타났다. ∆cagA 및 cagA-EPISA 균주에 의한 감염은 SFK 를 활성화하지 못하였으며, 이는 SFK 활성화가 CagA 인산화 이후 단계에서 발생함을 시사한다. 추가로, 특정 siRNA 와 억제제를 사용한 실험을 통해, H. pylori-매개 SFK 활성화가 Shp2–Raf–Mek–Erk 신호 경로를 통해 조절됨을 확인하였다. 또한, SFK 억제는 ERK 활성화 및 IL-8 생성에는 영향을 미치지 않았지만, wound healing assay 와 transwell invasion assay 에서는 H. pylori 감염에 따른 세포 이동성과 침습성이 크게 감소하였다. 이는 감염 과정에서 SFK 가 숙주 세포 이동성 조절에 중요한 역할을 한다는 점을 보여준다. 본 연구는 CagA 인산화를 매개하는 주된 키나아제가 SFK 라는 기존 관점을 재고하게 한다. 오히려 SFK 는 CagA 인산화 이후 ERK 경로를 통해 활성화될 수 있으며, CagA 인산화는 다른 키나아제에 의해 매개될 가능성을 제시한다. SFK 는 CagA 인산화, ERK 활성화, 세포 신장, IL-8 생성에는 필수적이지 않았지만, H. pylori 감염에 따른 세포 이동 및 침습에는 결정적인 역할을 수행하였다. 이 연구는 감염 과정에서 SFK 가 숙주 세포 이동성을 조절하는 데 있어 필수적이며, 지금까지 간과되었던 그 역할을 새롭게 평가한 것이다.