Investigation of biofilm expansion in Streptococcus mutans through EPS osmotic behavior and hydroxyapatite interactions

Abstract

Dental caries remains a significant global public health challenge affecting individuals across all age groups. Streptococcus mutans (S. mutans) is widely recognized as a keystone pathogen in dental caries development. However, the mechanisms by which this non-motile bacterium rapidly colonizes tooth surfaces and forms cariogenic biofilms remain incompletely understood. Previous studies have demonstrated that biofilms of both motile and non-motile bacteria can expand through osmotic pressure-mediated processes. This study aimed to investigate the osmotic pressure-mediated expansion patterns of S. mutans biofilms and identify key physical and chemical factors contributing to spatial expansion across tooth surfaces. To analyze osmotic effects mediated by extracellular polymeric substances (EPS) within S. mutans biofilms, an abiotic model system utilizing dextran solutions was employed. Fluorescent nanoparticles were used to track water movement into the biofilm matrix. Additionally, pH changes resulting from acid production by S. mutans were measured, and planktonic bacterial growth analyses under various acidic conditions were conducted to evaluate the effects of acidic environments and hydroxyapatite on bacterial growth and colony formation. To characterize S. mutans biofilms under different nutritional conditions, an air-solid interface model with semipermeable membranes was utilized on agar plates supplemented with 1% glucose, 1% sucrose, or 1% sucrose with 1% hydroxyapatite. Biofilm development was evaluated over 6 days using stereomicroscopy and image analysis, focusing on expansion patterns, EPS production, and microcolony formation. Results revealed that S. mutans biofilms expand through a unique two-stage process, distinct from expansion mechanisms observed in other bacterial species. The EPS model experiments demonstrated increased height and spreading of dextran solutions due to water absorption from surrounding agar media, indicating sufficient osmotic pressure formation to drive outward EPS flow. Viable bacteria were confirmed within the EPS matrix, demonstrating that the matrix serves as a vehicle for bacterial transport to new locations. Planktonic growth analyses showed significant growth inhibition under acidic conditions, confirming that the buffering capacity of hydroxyapatite is essential for stable S. mutans biofilm colony formation. Analysis of S. mutans biofilm expansion patterns showed that only biofilms grown in media containing both sucrose and hydroxyapatite exhibited significant expansion. In contrast, biofilms grown in media containing only glucose or sucrose showed no significant expansion despite daily media replacement. Under conditions containing both sucrose and hydroxyapatite, EPS matrix spread outward due to osmotic pressure, followed by new colony formation in hydroxyapatite-containing environments. Microcolony analysis within biofilms revealed distinct morphological differences based on distance from the initial inoculation site. Colony size increased with distance from the original inoculation zone, confirming gradually improving growth conditions with increasing distance. In conclusion, this study demonstrated a novel two-stage expansion process in S. mutans biofilms involving osmotic pressure-driven EPS matrix spreading followed by new colony formation in hydroxyapatite-containing environments. This expansion pattern differs from conventional biofilm development mechanisms and explains how non-motile S. mutans biofilms can rapidly colonize tooth surfaces in sucrose-rich environments. The essential roles of EPS osmotic properties and environmental pH regulation provide new insights into cariogenic biofilm behavior and present additional scientific evidence for developing prevention and treatment strategies targeting EPS. This research advances understanding of cariogenic biofilm development and is expected to contribute to establishing effective preventive strategies against dental caries.

치아우식증은 전 세계적으로 모든 연령층에 영향을 미치는 중대한 공중보건 문제로 자리 잡고 있다. Streptococcus mutans (S. mutans)는 치아우식증의 발생에 핵심 역할을 하는 주요 원인균으로 널리 알려져 있으나, 비운동성 세균인 이 균주가 치아 표면에서 빠르게 집락화하고, 우식성 생물막을 형성하는 기전은 지금까지 충분히 규명되지 않았다. 이전 연구에서는 운동성 및 비운동성 세균의 생물막이 삼투압에 의해 주변으로 확장될 수 있음을 보였다. 본 연구는 S. mutans 생물막의 삼투압 매개 확장 양상을 분석하고, 치아 표면 전반으로의 공간적 확장에 기여하는 주요 물리적 및 화학적 인자를 규명하고자 하였다. S. mutans 생물막 내 세포 외 고분자 물질(EPS)에 의한 삼투효과를 분석하기 위해 덱스트란 용액을 활용한 비생물학적 모델 시스템을 적용하였고, 형광 나노입자를 이용하여 생물막 기질 안으로의 수분 이동을 추적하였다. 또한, S. mutans의 산 생성으로 인한 pH 변화를 측정하였고, 다양한 산성 조건에서의 부유 상태의 세균 성장 분석을 통해 산성 환경 및 수산화인회석(hydroxyapatite)이 세균 성장 및 군집 형성에 미치는 영향을 평가하였다. S. mutans 생물막을 다양한 영양 조건하에서 특성화하기 위해 1% 포도당(glucose), 1% 자당(sucrose) 또는 1% 자당과 1% 수산화인회석이 첨가된 한천 배지 상에 반투과성 막을 위치시킨 공기-고체 계면 모델을 활용하였다. 생물막의 발달은 실체현미경과 이미지 분석을 통해 6일 동안 평가하였으며, 생물막의 확장 양상, 세포 외 고분자 물질(EPS) 생성, 미세 군집 형성을 분석하였다. 연구 결과, S. mutans 생물막은 기존에 알려진 다른 세균 종의 확장 방식과는 달리, 두 단계의 독특한 방식으로 확장됨을 확인하였다. EPS 모사 실험 결과, 주변 한천 배지로부터의 수분 흡수로 인한 덱스트란 용액의 높이 증가와 확산이 관찰되었으며, 이는 EPS의 외부 유동을 유도하기에 충분한 삼투압이 형성되었음을 시사하였다. 또한, EPS 기질 내에서 생존 가능한 세균의 존재를 확인하였고, 해당 기질이 세균을 새로운 위치로 운반하는 역할을 수행함을 입증하였다. 부유 상태의 성장 분석에서는 pH 6.5 이하에서 세균의 성장이 현저히 억제되었고, 이는 수산화인회석에 의한 완충이 S. mutans 생물막의 안정적인 군집 형성에 필수적임을 보여주었다. S. mutans 생물막의 확장 양상 분석 결과, 자당과 수산화인회석을 모두 포함한 배지에서 배양한 생물막만이 빠른 확장을 보였으며, 6일 이내에 초기 크기의 두 배 이상으로 증가하였다. 반면, 포도당 또는 자당만 포함된 배지에서는 매일 배지를 교체하였음에도 불구하고 유의미한 확장을 보이지 않았다. 자당과 수산화인회석이 모두 포함된 조건에서는 삼투압에 의해 EPS 기질이 외부로 확산되고, 이후 수산화인회석이 포함된 환경에서 새로운 군집 형성이 이루어졌다. 생물막 내 미세 군집 분석 결과 초기 접종 부위로부터 거리가 증가함에 따라 형태학적 차이가 뚜렷하게 나타났다. 군집의 크기는 경계로부터 0.5 mm 지점에서 약 0.0015 mm², 3.0 mm 지점에서는 약 0.003 mm²로 증가하였고, 거리 증가에 따라 성장 환경이 점진적으로 개선되었음을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구는 S. mutans 생물막이 삼투에 의한 EPS 기질 확산과 그에 이은 수산화인회석 함유 환경에서의 새로운 군집 형성을 통해 확장되는 새로운 두 단계 확장 과정을 제시하였다. 이러한 확장 양상은 기존 생물막 발달 기전과는 상이하며, 자당이 풍부한 환경에서 비운동성 S. mutans 생물막이 치아 표면에 빠르게 집락화하는 기전을 설명할 수 있다. 또한, EPS의 삼투 특성과 환경 pH 조절의 필수적인 역할은 우식성 생물막의 거동에 대한 새로운 통찰을 제공하며, EPS를 표적으로 하는 예방 및 치료 전략 개발에 추가적인 과학적 근거를 제시하였다. 본 연구는 우식성 생물막의 발달에 대한 이해를 심화시키고, 치아우식증의 효과적인 예방 전략 수립에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.