In vivo overexpression of reprogramming factor Oct4 enhances remyelination in Krabbe disease

Abstract

Krabbe disease, a rare progressive genetic disorder, is caused by a deficiency of galactocerebrosidase (Galc). Patients with Krabbe disease exhibit characteristics such as deterioration of mental and motor functions, muscle weakness, muscle stiffness, myoclonic seizures, rigidity, fever, blindness, swallowing difficulties, and hearing impairment. Hematopoietic stem cell therapy and Galc enzymatic therapy have been used to alleviate the symptoms of Krabbe disease, but there is currently no cure. Therefore, fundamental therapeutic strategies are needed to cure Krabbe disease. Oct4, also known as Oct3 or Oct3/4, is a key transcription factor encoded by the Pou5f1 gene. During embryonic development, Oct4 is highly expressed in pluripotent and germline cells, but its expression rapidly decreases upon differentiation. Thus, Oct4 is considered a master regulator for initiating and maintaining pluripotent cells during embryonic development and in adult stem cells. Previous studies have shown that overexpression of Oct4 alone or in combination with other reprogramming factors induces plasticity in cells. In the twitcher mouse, one of the animal models for Krabbe disease, AAV9-Oct4 was intraventricularly injected within 12 hours after birth. Motor performance was assessed weekly (rotarod, wire‑hang, open‑field). At post‑natal day 37, we analysed brain tissue by qRT‑PCR, GALC enzyme assay, diffusion‑tensor MRI, Luxol‑fast‑blue/PAS staining, immunofluorescence and RNA‑seq. Oct4-treated mice retained motor coordination and grip strength up to day 35, whereas untreated and AAV‑GFP controls declined. Fractional anisotropy in the corpus callosum increased by 29%, paralleled by preserved myelin basic protein staining and luxol-fast blue/PAS staining. Oct4 up‑regulated oligodendrocyte‑lineage markers and down‑regulated astroglial GFAP in the striatum. RNA‑sequencing in the striatum revealed enrichment of oligodendrocyte‑differentiation pathways without changes in cell division or cell cycle pathways. A single neonatal AAV9‑Oct4 dose enhances oligodendrocyte regeneration and myelin integrity, translating into functional benefit and modest survival benefit in twitcher mice-despite persistent GALC deficiency. In vivo Oct4‑mediated reprogramming therefore represents a promising adjunct or bridge therapy for Krabbe disease and potentially other genetic demyelinating disorders.

본 논문은 크라베병에서 생체 내 리프로그래밍 인자 Oct4의 재수초화 유도 효과를 확인했다. 크라베병은 갈락토세레브로시다제(Galactocerebrosidase) 효소 결핍으로 인한 치명적인 탈수초성 질환으로, 전체 환자의 약 85-90%가 영아기에 발병하며 90% 이상이 2세 이내에 사망한다. 현재 조혈모세포 이식이 유일한 치료법이나 근본적인 해결책은 아니다. Galc 결핍으로 인해 갈락토실세라마이드와 사이코신이 축적되어 세포 독성을 일으키고, 희소돌기아교세포 분화를 억제하며 염증을 증가시킨다. Oct4는 배아줄기세포의 다능성 유지에 핵심적인 전사인자로, 리프로그래밍을 통해 다양한 세포를 신경줄기세포나 희소돌기아교세포로 분화시킬 수 있다. 본 연구는 크라베병 동물모델인 twitcher 마우스에서 Oct4의 재수초화 효과를 검증하였다. 생후 1일 이내에 AAV9-Oct4를 뇌실 내 주입하고, 생후 21일, 28일, 35일차에 행동 실험을 실시하였다. Oct4군은 대조군 대비 rotarod (4 rpm, 4-40 rpm)에서 평균 47% (P < 0.01), hanging wire test에서 39% (P = 0.02) 향상된 운동 수행력을 보여 운동 기능 저하가 유의하게 완화되었다. 영상학적 분석에서 MRI-DTI를 통해 뇌량 및 대뇌백질의 fractional anisotropy가 0.32에서 0.38로 18% 증가하였고 (P < 0.01), T2-가중 영상에서는 부종 신호가 감소하였다. Luxol fast blue와 MBP 염색 분석 결과 탈수초 면적이 42% 감소하여 수초 보존 효과를 확인하였다. 세포학적 분석에서 뇌량의 Olig2⁺ 희소돌기세포 계열 세포와 nestin⁺ 전구세포가 각각 2.6배, 1.9배 증가한 반면, GFAP⁺ 반응성 성상세포는 31% 감소하였다. BrdU 이중 표지 실험을 통해 신생 세포의 62%가 Olig2⁺로 분화됨을 확인하여 Oct4가 신경 전구세포의 희소돌기아교세포 분화를 촉진함을 입증하였다. 분자학적 기전 분석을 위해 Oct4군과 GFP 대조군의 선조체에서 RNA-seq을 실시한 결과, 총 427개의 차등 발현 유전자가 검출되었다. Gene Ontology 분석에서 oligodendrocyte differentiation 및 myelination 경로가 유의하게 상향 조절되었으며, 특히 DRD3, DLX2, NLGN3 등 핵심 희소돌기아교세포 분화 관련 유전자들이 현저히 증가하였다. 또한 혈관 및 이온/대사체 수송, 세포 부착 및 이동, 신호 전달 관련 유전자들도 광범위하게 증가하였다. 반면 면역 반응, 염증 및 apoptosis 관련 유전자들은 전반적으로 억제되었고, astrocyte 분화 및 MAPK/STAT 신호전달 경로가 하향 조절되었다. 이는 Oct4가 희소돌기아교세포 분화 촉진과 동시에 염증성 환경을 완화하여 재생에 유리한 미세환경을 조성하는 이중 기전을 갖고 있음을 시사한다. 중요하게도, 세포 분열 및 세포 주기 관련 유전자들은 통계적 유의성에도 불구하고 생물학적 유의성 기준(

Fold Change

≥ 1.2) 미만의 변화만을 보여, Oct4 과발현이 비정상적인 세포 증식을 유도하지 않음을 확인하였다. H&E 염색에서도 형태학적 이상이나 이형성증의 증거는 관찰되지 않았다. 본 연구는 신생아기 AAV9-Oct4 단회 주입을 통해 Galc 효소 결핍을 직접 교정하지 않고도 내재성 신경 전구세포의 희소돌기아교세포 계열 전환을 촉진하여 재수초화와 운동 기능 보존을 달성할 수 있음을 증명하였다. 이는 효소 대체 요법이나 유전자 교정과는 다른 새로운 접근법으로, 생체 내 리프로그래밍이 크라베병과 같은 탈수초성 질환에 대한 혁신적인 치료 전략이 될 수 있음을 시사한다.