Generation and quality control of single-nucleus multi-omics data in a cancer-immune cell mixture

Abstract

Single-cell studies have enabled the exploration of cellular heterogeneity, the identification of rare cell types, and the investigation of developmental processes and cell fate. However, single-cell studies focusing on a single modality provide only partial insights into the complex gene regulatory networks within cells. To address these limitations, experimental methods have been developed to simultaneously analyze the genome, epigenome, transcriptome, and proteome within the same cells. Currently, droplet-based methodologies are widely used for multiomics studies, but they are costly and have low throughput. In this study, SHARE-seq (Simultaneous High-throughput ATAC and RNA Expression with Sequencing) was applied to generate and analyze libraries from a mixed sample of the immune cell line NK92 and the colorectal cancer cell line HCT116. SHARE-seq, a combinatorial indexing-based method, offers higher throughput and improved cost efficiency compared to conventional droplet-based multiomics techniques. Using this method, chromatin accessibility and gene expression profiles specific to each cell line were identified at the single-nucleus level within the mixed sample. Furthermore, UMAP analysis revealed distinct clusters corresponding to the NK92 and HCT116 cell lines for each modality. Finally, nuclei with matching barcodes in both snATAC-seq and snRNA-seq clusters were identified. These nuclei represent high-quality samples for further analyses, such as Weighted Nearest Neighbor (WNN) analysis or studies on the functional relationships of regulatory elements controlling gene expression. This study demonstrates that simultaneous analysis of chromatin accessibility and gene expression at the single-nucleus level in a cancer-immune cell mixture enables the precise distinction between immune and cancer cell lines by leveraging data from two modalities within the same nucleus. Additionally, it highlights the potential to identify high-quality nuclei for future analyses aimed at exploring the functional relationships of regulatory elements governing gene expression. These findings are expected to contribute to the precise identification of cell types and enhance our understanding of cell-cell interactions and gene regulatory networks in complex biological systems, such as the tumor microenvironment (TME). Moving forward, the integration of single-cell multiomics data is anticipated to be widely applied for characterizing and analyzing cell types in tissues composed of diverse cell populations or within specific in vivo environments.

단일 세포에 대한 연구는 세포 간 이질성 탐구, 희귀 세포 유형의 식별, 발달 과정 및 세포 운명에 관한 연구를 가능하게 했다. 그러나 단일 모달리티에 의존한 단일 세포 연구는 세포 내 복잡한 유전자 조절 네트워크에 대한 제한된 정보를 제공한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 동일 세포에서 게놈, 후성유전체, 전사체 및 프로테옴을 함께 분석할 수 있는 실험적 방법들이 개발되었다. 현재, 다중유전체학에서 드롭릿 기반의 방법들이 널리 사용되지만, 비용이 높고 처리량이 낮은 단점이 있다. 본 연구에서는 SHARE-seq (Simultaneous High-throughput ATAC and RNA Expression with Sequencing)을 적용하여 면역 세포주인 NK92와 대장암 세포주인 HCT116의 혼합체에서 라이브러리를 생산하고 분석했다. SHARE-seq은 조합 인덱싱 기반의 방법으로, 기존의 드롭릿 기반 다중유전체 기술에 비해 더 높은 처리량과 비용 효율성을 제공한다. 이 방법을 통해 면역세포와 암세포가 혼합된 샘플 내에서 각 세포주에 특이적인 염색질 접근성과 유전자 발현 프로파일을 단일 핵 수준에서 확인했다. 또한 UMAP 분석을 통해 NK92와 HCT116 세포주에 해당하는 뚜렷한 클러스터를 각각의 모달리티에서 구분했다. 마지막으로 snATAC-seq과 snRNA-seq 각각의 클러스터에서 일치하는 바코드를 가진 핵들을 확인하였다. 이 핵들은 추후 가중 최근접 이웃(WNN) 분석이나 유전자 발현을 조절하는 조절 요소들의 관계 연구에 활용 가능한 고품질 핵이다. 본 연구는 종양-면역 세포주 혼합 샘플에서 단일 핵 수준으로 염색질 접근성과 유전자 발현을 동시에 분석함으로써, 하나의 핵에서 두 가지의 모달리티를 활용해 면역 세포주와 대장암 세포주를 정밀하게 구분할 수 있음을 입증했다. 또한 향후 염색질 접근성과 유전자 발현 데이터를 통합하여 유전자 발현을 조절하는 조절 요소들의 기능적 관계를 연구할 수 있는 고품질의 핵들을 식별할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 종양 미세환경(TME)과 같은 복잡한 생물학적 시스템에서 세포 유형을 정밀하게 식별하고, 세포 간 상호작용과 유전자 조절 네트워크를 이해하는 데 기여할 것으로 기대된다. 단일 세포 다중유전체 데이터 통합이 다양한 세포 유형으로 구성된 조직이나 특정 생체 내 환경에서 세포 유형 특성화와 정밀한 분석에 널리 활용될 것으로 기대된다.