Modulating mechanism of neuroinflammation following brain ischemic stroke through T cell regulation

Abstract

본 연구는 T세포 조절을 통해 허혈성 뇌졸중 후 발생하는 신경 염증 반응을 완화할 수 있는 기전에 관한 내용을 담고 있다. 허혈성 뇌졸중이 발생하면 신경염증 반응, 세포 대체, 기능 회복의 세 가지 주요 단계를 거치며 증상이 진행되는데 첫 번째 신경염증 반응 가속화 단계에서 비 가역적인 신경 손상이 발생하기 때문에 이 초기 단계를 조절하는 것이 중요하다. 초기 신경염증 반응 단계에서는 다양한 세포들이 손상된 혈액-뇌 장벽을 통해 침투하며, 그 중에서도 세포독성 T 세포(Cyto T)는 경색 부위에서 신경염증을 증폭시키며 신경세포의 직접적인 사멸을 유도한다. T세포 조절을 통한 염증반응 완화에 관한 보고를 담고 있는 선행연구들에 의하면 다른 효과기 T세포 대비, 조절 T 세포(Treg) 비율을 증가시키면 염증 상태를 완화할 수 있음을 보여주었다. 특히, 면역 조절제로 알려진Poly-Glu/Tyr(P-YE)를 마우스에 주사하면 염증 유발 부위 주변에Treg 세포의 양이 증가하고 이로 인해 신경 손상으로 인한 행동기능 저하가 개선되었다는 보고들이 있지만, 그 기전은 아직 규명되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 P-YE와 상호작용하는 인자를 선별하고 이러한 상호작용이 어떻게T 세포를 조절하여 신경염증 반응을 완화하는지 그 기전을 규명하고자 하였다. 먼저 P-YE와 상호작용하는 인자를 찾아내기 위해 단백질 마이크로 어레이 실험을 실시하였으며, P-YE는 21,000개의 종류의 단백질을 포함한 어레이 칩에 반응되었다. in vitro 실험에서 8주령 C57BL/6 수컷 마우스의 비장으로부터 Cyto T 세포(CD8+ T)를 분리하였으며, 재관류 후 조직내 유입 시 신경염증인자가 방출된 환경에 노출되는 상황을 모방하기 위해 산소-포도당 결핍 조건 미세아교세포 배지(OGD 조건 배지, OGD-CM)에서 P-YE가 탑재된 나노입자 (Np P-YE)와 함께 24시간동안 배양되었다. 또한, tMCAO 수술을 진행한 생체 실험에서 P-YE는 CCA를 통해 주사 되어 MCA부근까지 유입될 수 있도록 하였다. 그 결과, P-YE는 tMCAO 수술 후 경색 부피를 감소시키고 행동 기능을 개선하였으며, 이러한 현상학적 결과의 원인이 되는 기전을 밝히기 위한 단백질 마이크로어레이 실험에서, P-YE는 ROS를 분비하는 NOX 복합체의 일부인 호중구 세포질 인자(NCF1)에 강하게 결합하는 것을 확인하였다. 이 NCF1은 염증 반응에서 활성화되어Moesin에 결합하여 막으로 이동하고 NOX 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있으며 이 결과를 바탕으로 해당 기능을 가지고 있는 CD8+세포가 타깃세포로 설정되었다. Co-IP 실험에서는 CD8+T세포에서 P-YE와 NCF1의 결합으로 인해 기존에 결합하고 있던 NCF1-Moesin의 복합체의 감소가 확인되었다. NCF1과 결합하지 않은 Moesin은 FOXP3 발현을 위한 신호전달 경로에 합류될 수 있다는 선행연구를 근거로 진행한 실험에서, O+P-YE 그룹에서 CD8+ T 세포에서 FOXP3+가 발현되는 것을 확인하였으며 이 그룹에서 ROS 및 전 염증성 사이토카인 수치가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. P-YE가 주입된 tMCAO 모델링 마우스에서는 경색 부위 주변에서 실제로 CD8+FOXP3+ T 세포가 이동된 것이 관찰되었으며, 같은 영역에서 ROS 발현양와 전 염증성 표현형인 M1 타입의 미세아교세포의 수가 감소하였다. 결론적으로 분자적 관점에서, P-YE와 결합한 NCF1은 NOX 복합체를 형성하지 못하였고 NCF1로부터 분리된 Moesin은 FOXP3 발현을 유도할 수 있었다. 따라서, 이 연구를 통해 P-YE가 신경염증 조건에서 NCF1에 결합하여 NCF1-Moesin 신호경로에 영향을 미쳐 일부 CD8+ T 세포를 CD8+FOXP3+ 세포로 전환시킴을 알 수 있었고, 이러한 기전을 통해 결과적으로 ROS 생성과 전 염증성 사이토카인 발현이 억제되어 사멸된 신경세포의 양을 감소시키심으로써 신경학적 손상으로 인한 행동기능 약화를 개선하는 하나의 역할을 수행할 수 있다는 결론을 도출하였다.

When an ischemic stroke occurs, it progresses through three major stages: neuroinflammatory response, cell replacement, and functional recovery. Since irreversible neural damage occurs due to the neuroinflammatory response in the initial stage, regulating this first stage is crucial. In the first stage of the neuroinflammatory response, various cells infiltrate through the disrupted blood-brain barrier. Among them, the cytotoxic T (Cyto T) cells infusing to the infarct site enhance the neuroinflammation. Previous studies have shown that increasing the proportion of regulatory T (Treg) cells relative to Cyto T cells can alleviate inflammatory conditions. Poly-Glu/Tyr polypeptide (Poly-YE; P-YE) has been reported as one of the key immune modulators that regulate T cell balance by recruiting Treg cells and improving behavioral outcomes caused by neurological damage. However, the mechanism is still unclear. Therefore, this study aimed to identify the factors that interact with P-YE and to elucidate how these interactions regulate T cells to alleviate the neuroinflammatory response. For the protein microarray experiment, P-YE (4.32 mg/mL) was treated on 21,000 protein chips. P-YE loaded on Nanoparticles (Np P-YE; 3ug/mL) was treated to primary Cyto T (CD8+ T) cell isolated from the spleen of 8-week-old C57BL/6 male mouse. These cells were cultured in Oxygen-Glucose Deprivation-conditioned microglia medium (OGD-conditioned medium; CM) to mimic exposure to neuroinflammation. In vivo experiment, tMCAO surgery was proceeded and P-YE (1mg/kg) was injected to CCA. The results showed that P-YE reduced infarct volume following tMCAO surgery and improved the behavioral functions against tMCAO. P-YE strongly bound to neutrophil cytosolic factor (NCF1), which is a part of the NOX complex which secrete ROS in protein microarray experiment. These results identified CD8+ T cells as the target cells for regulation. In the Co-IP experiment, the liberation of Moesin due to the binding of NCF1 to P-YE was confirmed. In the inflammatory response, activated NCF1 is known to bind to Moesin to migrate forward to the membrane and assemble into the NOX complex. Additionally, FOXP3+ was expressed in CD8+ T cells in the O+P-YE group. Moreover, in this group, the levels of superoxide and cytokines were remarkably decreased. In tMCAO modeling mice injected with P-YE, CD8+FOXP3+ T cells were observed around the infarct area. Also, ROS and the pro-inflammatory phenotype of microglia was reduced. Taken together, NCF1 bound to P-YE can’t form NOX complex and Moesin dissociated from NCF1 can lead to FOXP3 expression. Therefore, P-YE binds to NCF1 under neuroinflammatory conditions, converting some CD8+ T cells into CD8+FOXP3+ cells, thereby inhibiting ROS production and exerting anti-inflammatory effects.