Directly reprogrammed smooth muscle cells contribute to neovascularization

Abstract

Ischemic cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality. Despite the availability of treatment options, treating patients with severe conditions of peripheral vascular or artery disease remains a major challenge, as they might be unamendable to these conventional options, including medications, and interventional and surgical procedures. The main pathophysiology of ischemic cardiovascular diseases is vascular insufficiency or compromised blood flow and vessels. Hence, therapeutic neovascularization has emerged as a promising therapeutic approach not only to compensate for the loss of blood flow, but also to re-construct a functional vasculature that can support a proper blood perfusion and tissue repair. Neovascularization consists of three processes; they are: (1) vasculogenesis, the de novo development of blood vessels from endothelial progenitor or stem cells; (2) angiogenesis, the growth of pre-existing vessels, by which endothelial cells play a critical role in; and (3) arteriogenesis, the growth and maturation of relatively larger vessels via smooth muscle cell (SMC) recruitment and investment. In an ischemic condition, angiogenesis alone has a limited capacity to restore effective perfusion to compromised tissues; and thus, arteriogenesis may 2 be the key mechanism to enhance perfusion, highlight its significance in the rescue of ischemic tissues. Therefore, smooth muscle cells, which participate in induction of arteriogenesis, might be of great therapeutic benefit. Among existing modalities, application of human pluripotent stem cells (hPSCs), which include human embryonic and induced pluripotent stem cells, was and still is utilized to differentiate into SMCs, but its scalability and long-term safety concern may hinder the clinical application. Subsequently, direct reprogramming or transdifferentiation, which directly converts fully differentiated somatic cells into specific lineage cells without an intermediate pluripotent stage, has been developed to overcome the drawbacks of use of hPSCs. Myocardin (MYOCD), a contractile SMC-fate determining transcription factor, has been used to generate contractile SM-like cells directly from somatic cells. There has, however, been considerable uncertainty concerning the capacity of MYOCD alone to generate a contractile SMC lineage. Treatment with all-trans retinoic acid alone has been shown to induce a battery of contractile SMC markers, such as SM a-actin and SM-myosin heavy chain, independently of transduction with MYOCD. Therefore, I sought to develop a reproducible protocol for direct reprogramming of human fibroblasts into functional, contractile, reprogrammed SMCs by a combination of MYOCD and all-trans retinoic acid, and to determine their therapeutic potentials in a murine model of hindlimb ischemia.

우리나라 사망원인 통계조사에 따르면, 심장질환에 의한 사망률이 지속적으로 증가하는 추세를 보이고 있으며, 10대 사망원인 순위 중 2, 3위가 심장 질환과 뇌혈관 질환으로 보고되었다. 특히, 세계보건기구의 “전 세계 10대 사망원인” 및 국내 통계청의 “2011년 사망원인 통계”를 일부 발췌하여 정리된 질병관리본부의 보고서에 의하면 전 세계 사망원인 1위가 허혈성 심혈관 질환으로 보고되었다. 따라서, 허혈성 심혈관 질환은 높은 사망률로 인하여 주요한 건강문제로 인식되고 있으며, 적절한 관리방안 마련이 필요하다. 관리방안으로 약물치료 및 심혈관중재술과 혈관우회로술 등의 수술적 치료가 있으나, 수술에 실패한 환자나 수술이 불가능한 환자의 경우에는 현재로는 별다른 치료법이 없는 설정이다. 심지어, 말초동맥질환 환자의 경우에는 사지의 일부를 절단해야만 하는 상황까지 처할 수도 있다. 따라서, 이러한 환자를 위한 대안적 치료방법으로 줄기세포분화법 또는 직접교차분화법을 이용한 신혈관형성이 각광받고 있다. 허혈성 심혈관 질환의 근본적인 원인은 혈관 장애 및 소실 들의 문제로 본 질환을 치료하기 위해 신혈관형성과정이 절대적이다. 신혈관형성을 위한 필수적 요소로는 혈관을 93 구성하는 주요 세포인 혈관내피세포와 평활근세포가 필요하다. 이와 관련해서, 평활근세포의 중요성이 꾸준히 연구가 되고 있다. 특히, 신혈관형성과정 중 신생동맥형성과 측부순환에 평활근세포가 막대한 역할을 한다는 것을 입증한다. 최근 줄기세포에서 유래한 평활근세포의 분화방법 확립 및 신혈관형성 촉진 가능성에 대한 연구가 끊임없이 진행되고 있으나, 이를 허혈성 심혈관 질환에 적용하기 위해서는 줄기세포가 갖는 한계점을 극복해야 한다. 인지되고 있는 한계점으로는 1) 낮은 줄기세포 분화율, 2) 높은 종양발생 가능성, 그리고 3) 장기간 분화 과정으로 높은 생산비용 및 낮은 효율성이 제시된다. 이러한 한계점을 극복한 새 대한으로 떠오르고 있는 기술이 직접교차분화법이다. 직접교차분화법은 목표하는 세포의 핵심 전사인자를 체세포에 강제로 과발현시켜 신경세포, 심근세포, 간세포 등 다양한 세포로의 전환을 유도하는 방법이다. 나아가 직접교차분화된 세포의 기능성에 대한 연구결과가 긍정적으로 발표되고 있다. 따라서, 신혈관생성을 통해 허혈성 심혈관 질환을 치료할 수 있는 평활근세포로의 직접교차분화법이 필요하다. 앞서 살펴본 바와 같이 평활근세포로 직접교차분화하는 방법을 개발하기 위해서는 평활근세포의 운명을 결정짓는 핵심 전사인자가 필요하다. 이와 관련된 학문의 연구를 조사한 결과 마이오카딘(myocardin/MYOCD)이 평활근세포의 운명을 결정짓는 핵심 전사인자로 보고된다. 마이오카딘는 세럼 리스폰스 팩터(serum response factor)와 상호작용하여 평활근세포의 특이적 유전자의 발현을 강화시킨다. 마이오카딘 유전자의 발현을 억제할 수 있는 소간섭 리보핵산 현상을 이용하여 평활근세포의 특이적 유전자의 발현을 감소하는 것을 관찰하였으며, 마이오카딘 유전자가 결핍된 동물에서 평활근세포의 소실로 인한 배아치사율이 보고됨에 따라 마이오카딘이 평활근세포의 운명을 결정짓는 데에 있어 중요한 전사인자임을 시사한다. 94 또한, 비타민 에이산의 대사체인 올트랜스레티노익산을 이용하여 평활근세포의 특이적 유전자의 발현을 증가하는 것을 관찰하였다. 현재까지, 마이오카딘과 올트랜스레티노익산을 이용하여 직접교차분화를 유도한 연구결과가 없으며, 허혈성 질환 동물모델에서 적용하여 혈관 및 조직재생 효과를 검증한 연구는 보고된 바 없다. 따라서, 본 연구에서는 마이오카딘과 올트랜스레티노익산을 이용하여 인간진피섬유아세포에 과발현시켜 평활근세포로의 직접교차분화를 유도시키고, 신혈관생성을 통해 혈관 및 조직재생할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이를 통하여 직접교차분화된 평활근세포는 허혈성 심혈관 질환을 치료하는 세포로써 유용한 세포치료제 방법으로 제시된다.