Exploring the Therapeutic Potential of Using Alkylating Agent as a Novel Approach to Treat IDH1-Mutant Cholangiocarcinoma

Abstract

Mutation of the isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) gene is identified as a promising 'druggable target’ in intrahepatic cholangiocarcinoma (CCA) with its high incidence (~20%). An IDH1 inhibitor, Ivosidenib, received FDA approval for treating IDH1 mutant (IDH1mt) CCA, yet the objective response rate was only 2% in the phase 3 ClarIDHy trial. Thus, novel approaches to target IDH1 mutation are necessary. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent widely used to treat IDH1mt glioma. However, its cytotoxic effects have not been previously investigated in CCA. Therefore, our study explored whether TMZ has therapeutic potential for treating IDH1mt CCA. We utilized human CCA cell lines harboring a wild-type (WT) IDH1 (SNU-1196, SNU-245) or IDH1 mutations (RBE: R132S; SNU-1079: R132C). Characterization of IDH1mt CCA was achieved using a D-2-hydroxyglutarate (D2HG) assay and metabolic profiling (Fuel Flex Test). The cytotoxic effects of TMZ in CCA were evaluated with CCK8 assay, cell cycle analysis, immunoblot analysis, and immunocytochemistry. We confirmed a significant elevation of oncometabolite D2HG levels in IDH1mt CCA cells compared to IDH1 WT (p< 0.05). D2HG competitively inhibits α-KG dependent enzymes, which cause epigenetic dysregulation and metabolic reprogramming. Metabolomic assays revealed that IDH1mt and WT CCA cell lines use distinct metabolic pathways with the highest dependency on glycolysis and fatty acid oxidation, respectively. Drug screening revealed that all CCA cells are sensitive to gemcitabine (IC50: ~0.005-0.01uM), and inhibition of cell proliferation was unachievable with Ivosidenib (IC50 > 100μM) regardless of the IDH1 mutation status. However, we found that TMZ selectively inhibits IDH1mt CCA cell proliferation (IC50: ~600M) compared to IDH1 WT (IC50 > 1mM). TMZ induced more DNA damage in IDH1mt than WT CCA cells (~5 fold vs. ~1.2 fold in rH2AX expression following TMZ treatment). Furthermore, we noticed that Ivosidenib treatment induces G0-G1 arrest, while TMZ induces G2-M arrest in CCA. An increased TMZ-induced G2-M arrest was observable in IDH1mt (control vs. TMZ: 13.3% vs. 56%) than in IDH1 WT CCA cells (control vs. TMZ: 19.3% vs. 51.4%). Also, TMZ significantly reduced D2HG levels in IDH1mt CCA cells (p< 0.05), which resembles the mechanism of action of Ivosidenib. Our findings not only suggest that TMZ exhibits potent cytotoxic effects on IDH1mt CCA but also imply the synergistic effect of combining it with Ivosidenib, which exerts a cytostatic effect on CCA. We will validate these findings with ongoing studies involving CRISPR-Cas9-mediated genome editing and in vivo studies.

담도암은 간에서 생성된 담즙이 십이지장으로 배출되는 경로를 이루는 담관에서 유래하는 종양으로 우리나라는 전 세계에서 남성 2위, 여성 3위로 발병률이 다른 국가 대비 월등히 높은 편에 속한다. 조기 진단의 어려움과 해부학적인 위치상 근치적 수술이 매우 어렵기 때문에 담도암 환자의 예후는 현재까지도 매우 불량하다. 최근 NGS를 통해 IDH1 돌연변이가 간내담도암에서 높은 빈도로 일어난다고 밝혀졌으며, 이를 타겟하는 표적치료제인 Ivosidenib이 2021년 미 FDA에서 담도암 치료제로 승인을 받았다. 단, 제 3상 임상시험에서 객관적 반응률이 2%에 그쳐 약물의 효과가 매우 미미하므로 더욱 효과적인 치료 전략이 절실한 상황이다. Temozolomide는 알킬화제에 속하는 항암제로써 IDH1 돌연변이를 갖는 뇌종양의 표준 치료제로 사용되고 있다. 그러나, 담도암에서 Temozolomide의 약물 효과를 연구한 전례는 없다. 따라서, 본 연구는 담도암의 불량한 예후를 개선하기 위해 IDH1 돌연변이를 보유한 담도암의 종양 특성을 규명하고 알킬화제 약물 재배치의 가능성을 제시함으로써 다각도로 새로운 담도암 치료 전략을 수립하고자 하였다. 4개의 담도암 세포주를 이용하여 IDH1 변이 유무에 따른 세포 특성을 확립하였고 대사체 분석을 통해 IDH1 변이에 따른 담도암의 대사적 변화도 관찰하였다. 담도암 세포주에서 Temozolomide 및 Ivosidenib의 약물효과를 분석한 결과 IDH1 변이를 보유한 담도암 세포주에서 야생형 대비 Temozolomide에 더욱 민감한 점을 확인했으며 약물에 의한 DNA 이중나선 절단도 증가하여 세포 사멸을 더욱 유도하는 것을 발견했다. 또한, Temozolomide에 의한 G2/M 기의 arrest 역시 IDH1 변이를 보유한 담도암 세포주에서 야생형 대비 증가하는 것을 관찰하였다. Ivosidenib의 경우 G0-G1 arrest를 유도하는 것을 확인하였다. 더 나아가, Ivosidenib의 약물 기전과 비슷하게 Temozolomide이 IDH1 변이에 의해 세포 내 비정상적으로 축적된 oncometabolite인 D2HG의 농도를 낮추는데 기여하는 것도 확인하였다. 본 연구에서는 세포 사멸을 유도하는 Temozolomide과 세포 성장을 억제하는 Ivosidenib을 병용했을 때 시너지 효과가 있으며 암세포 사멸이 더욱 증가하는 것을 in vitro 상에서 확인하였다. 이로써, Temozolomide이 IDH1 돌연변이를 보유한 담도암 치료에 있어 유망하며 향후 Ivosidenib 약물과의 병용 치료로써의 가능성이 있음을 제시하고자 한다.