Single-cell DNA sequencing has revealed the evolution of resistant clones to Third-generation EGFR-TKIs in non-small cell lung cancer

Abstract

Third-generation EGFR-TKIs, such as targeted agents, have significantly improved patient outcomes, but drug resistance inevitably develops. In non-small cell lung cancer (NSCLC) resistant to third-generation EGFR-TKIs, genetic alterations, including MET, ERBB2, and EGFR C797S, have been reported, and there is ongoing debate regarding whether resistance mechanisms occur mutually exclusively or if oncogenic EGFR mutations are acquired. We investigated genetic heterogeneity in 49 patients with advanced EGFR-mutant NSCLC at baseline and after developing resistance using next-generation sequencing (NGS). To determine whether resistance-associated mutations and activating EGFR mutations coexist within a single cancer cell or arise in distinct cell populations, we performed single-cell DNA sequencing (scDNA-seq) on tumor samples from five patients with disease progression on third-generation EGFR-TKIs. Furthermore, osimertinib-resistant cell lines were established, and subjected to scDNA-seq, and the identified mutations were functionally characterized through in vitro experiments. Single-cell analysis revealed that EGFR-dependent somatic mutations arise within EGFR oncogenic clones, while EGFR-independent mutations with low variant allele frequencies occur mutually exclusively. Furthermore, somatic mutations and multiple copy number alterations emerged at distinct spatial and temporal points during treatment with third-generation EGFR-TKIs. This study highlights the genetic heterogeneity, clonal evolution, and spatial distribution patterns of tumor cells associated with resistance to third-generation EGFR-TKIs. These findings provide a rationale for combination therapy intensification in managing EGFR-mutant NSCLC patients.

표적 치료제인 3세대 EGFR-티로신 키나아제 저해제는 EGFR 돌연변이 비소세포폐암 환자의 예후를 상당히 개선했지만, 내성 문제는 계속해서 발생하고 있습니다. 대표적으로 MET, ERBB2의 유전자 증폭과 EGFR C797S와 같은 변이가 보고되었으며, 내성 기전이 상호 배타적으로 발생하는지, 혹은 기존 EGFR 발암성 변이에 계속 획득되는지에 대한 논쟁은 계속되고 있습니다. 우리는 차세대 염기서열 분석을 사용하여 진행성 EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 49명을 대상으로 유전적 이질성을 조사했습니다. 내성 관련 돌연변이와 활성화 EGFR 돌연변이가 단일 암세포 내에 공존하는지 또는 별개의 세포 집단에서 발생하는지 확인하기 위해 3세대 EGFR-TKI에 대한 질병 진행 환자 5명의 종양 샘플에 대해 단일 세포 DNA 시퀀싱(scDNA-seq)을 수행했습니다. 또한 오시머티닙 내성 세포주를 확립하고 환자와 같은 패널을 사용해 scDNA-seq를 진행했습니다. 확인된 돌연변이는 시험관 내 실험을 통해 기능적으로 특성화되었습니다. 단일세포 분석 결과, EGFR 발암성 돌연변이 내에서 EGFR 의존적 체세포 변이가 발생하는 반면, EGFR 비의존적 변이는 변이 대립 유전자 빈도가 낮고 EGFR 발암성 돌연변이와 상호 배타적으로 나타났습니다. 또한, 제3세대 EGFR-티로신 키나아제 저해제 치료 중 서로 다른 시점과 공간에서 체세포 변이와 다중 복제수 변이가 나타났습니다. 이 연구는 3세대 EGFR-티로신 키나아제 저해제에 대한 내성과 관련된 종양 세포의 유전적 이질성, 클론 진화 및 공간 분포 패턴을 강조합니다. 이러한 발견은 EGFR 돌연변이 폐암 환자 관리에서 병용 요법 강화에 대한 근거를 제공합니다.