Microbiome in Women with Endometriosis and the In Vitro Effects of Lactobacillus reuteri on Human Endometrium

Abstract

Background: Endometriosis (EMS) is a chronic inflammatory condition affecting approximately 10% of women of reproductive age. Recent research suggests that the human microbiome may play a crucial role in the development and progression of EMS due to its influence on immunomodulation and estrogen metabolism. However, the relationship between the microbiome and EMS remains incompletely understood. This study aims to evaluate microbiome composition differences in the reproductive organs, including the vagina, endometrium (EM), and peritoneal fluid (PF), between women with EMS and those without the disease. Additionally, the potential impact of Lactobacillus reuteri (L. reuteri) on EM was investigated through in vitro co-culture experiments. Methods: A total of 41 patients were included in the study, with samples taken from the vagina, EM, and PF. The composition of the microbiome was analyzed using 16S rRNA gene sequencing, targeting the V3 and V4 regions. Additionally, western blot analysis was conducted to identify proteins exhibiting differential expression during the co-culture of endometrial cells with L. reuteri, and this process was repeated following the addition of estradiol-17-glucuronide (E2G) to the culture medium. To assess estrogen metabolism mediated by L. reuteri, β-glucuronidase concentrations were measured using ELISA, while estradiol, E2G, and the estradiol/E2G ratio were evaluated using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Results: When comparing the overall microbiome composition between women with endometriosis and controls in the vagina, endometrium, and peritoneal fluid, no significant differences were observed in alpha and beta diversity indices between the two groups. However, when analyzing the relative abundance of operational taxonomic units and conducting LEfSe analysis, several bacteria exhibited significant differences between the two groups. Among various bacteria, L. reuteri was the only species that showed significant differences in both the vagina and endometrium, demonstrating relatively large differences compared to other species. The analysis of microbiome composition across the menstrual cycle revealed no changes at the genus or species levels in the EM and vagina. In contrast, a total of 60 genera and 76 species exhibited statistically significant differences in mean abundance in the PF during the follicular and luteal phases. When EM cells were co-cultured with L. reuteri at a multiplicity of infection of 1, western blot analysis revealed no significant alterations in endometriosis-related protein expression after 24 hours of co-culture. However, upon the addition of estradiol-17-glucuronide (E2G) to the culture medium, BAX/Bcl-2 expression decreased significantly compared to cells cultured with E2G alone without L. reuteri, while p-NF-κB expression was significantly increased only in the co-culture containing both L. reuteri and E2G. While estrogen receptor expression was not affected by the presence of L. reuteri, the expression of progesterone receptors α and β significantly decreased in EM cells co-cultured with both L. reuteri and E2G. To confirm estrogen metabolism mediated by L. reuteri, β-glucuronidase levels measured by ELISA significantly increased after 24 hours of co-culture, however, the estradiol/E2G ratio determined by LC-MS/MS remained unchanged, indicating that the conversion of E2G to estradiol was not facilitated. Conclusions: In conclusion, this study analyzed microbiome composition among the vagina, endometrium, and peritoneal fluid of women with endometriosis compared to controls. While L. reuteri is known as a beneficial bacterium, in vitro findings of this study suggests a potential shift towards anti-apoptotic conditions, which could inadvertently support EMS development by promoting cell survival. Future studies should explore the interactions of multiple bacterial species and varying hormonal conditions to better represent in vivo environments.

배경: 자궁내막증은 가임기 여성의 약 10%에서 발병하는 만성 염증성 질환이다. 최근 미생물군유전체가 자궁내막증의 발병과 진행에 영향을 줄 수 있다는 연구 결과들이 보고되고 있다. 본 연구는 자궁내막증 여성과 대조군의 생식 기관- 질, 자궁내막, 복막액-에서의 미생물군유전체 조성 차이를 분석하고, Lactobacillus reuteri (L. reuteri)가 자궁내막에 미치는 영향을 시험관내 공동 배양 실험을 통해 평가하고자 한다. 방법: 연구에 포함된 총 41명의 환자들의 질, 자궁내막, 복막액에서 샘플들을 채취하여, V3 및 V4 영역을 표적으로 하는 16SrRNA유전자 서열분석을 사용하여 미생물군유전체 조성을 분석하였다. 또한, 자궁내막세포를 L. reuteri와 공동 배양하면서 western blot을 시행하여 발현 차이를 보이는 단백질들을 확인하였고, 배양액에 에스트라디올 글루쿠로니드 (estradiol-17-glucuronide, E2G)를 추가하여 같은 과정을 반복하였다. L. reuteri에 의한 에스트로젠 대사를 확인하기 위해, ELISA를 통해 β-glucuronidase 농도를 측정하였고, LC-MS/MS를 통해 에스트라디올, E2G, 에스트라디올/E2G 비율을 평가하였다. 결과: 자궁내막증 여성과 대조군의 전체적인 미생물군유전체 조성을 질, 자궁내막, 복막액에서 비교하였을 때, 알파 및 베타 다양성 지표는 두 군 간에 유의미한 차이가 없었다. 그러나, 미생물 운영 분류 단위 (operational taxonomic unit)의 상대 풍부도와 LEfSe 분석을 시행하였을 때, 두 군 간 유의미한 차이를 보이는 세균들이 존재하였으며, 질, 자궁내막, 복막액에서 두 군 간 유의미한 차이를 보이는 세균들의 분류군을 속 (genus), 종(species) 단계에서 확인할 수 있었다. 여러 세균들 중, L. reuteri는 질과 자궁내막에서 모두 유의미한 차이를 보인 유일한 종이며, 다른 종들에 비해 두 군 간의 차이가 상대적으로 컸다. 월경 주기에 따라 미생물군유전체 조성이 변하는지 분석하였는데, 자궁내막과 질에서는 월경주기에 따라 속 또는 종 단계에서 조성의 변화가 없었으나, 복막액에서는 총 60개의 속과 76개의 종이 난포기와 황체기 동안 통계적으로 유의미한 풍부도의 차이를 나타냈다. L. reuteri와 감염 배율(multiplicity of infection, MOI) 1에서 공동 배양된 자궁내막 세포가 L. reuteri에 의해 직접적으로 나타내는 반응을 western blot을 이용하여 확인하였을 때, 자궁내막증 관련 단백질들은 24시간의 공동 배양 후 유의미한 변화가 나타나지 않았다. 그러나 E2G를 배양액에 추가했을 때, L. reuteri와 E2G를 모두 포함한 공동 배양에서 BAX/Bcl-2 발현이 유의미하게 감소하였고, p-NF-κB 발현은 유의미하게 증가하였다. 또한, 에스트로젠 수용체 발현은 L. reuteri의 존재에 의해 뚜렷한 영향을 받지 않았지만, 프로게스테론 수용체 α 및 β 발현은 L. reuteri와 E2G를 공동 배양한 자궁내막 세포에서 현저하게 감소했다. L. reuteri에 의한 에스트로젠 대사를 확인하기 위해, 24시간 공동배양 후 ELISA를 통해 확인한 β-glucuronidase 수치가 유의미하게 증가했으나, LC-MS/MS를 통해 확인한 에스트라디올/E2G 비율은 변하지 않아 E2G가 에스트라디올 로 변환되는 과정이 촉진되지 않았음이 나타났다. 결론: 본 연구는 자궁내막증 여성과 대조군의 질, 자궁내막, 복막액에서 차이를 보이는 미생물군유전체 조성을 규명하였으며, L. reuteri는 유익균으로 알려져 있으나 세포실험에서는 오히려 자궁내막세포의 세포사멸을 억제하는 반응을 유도하였다. 향후 연구에는 다양한 박테리아 종과 호르몬 조건의 상호 작용을 고려함으로써 생체 내 환경을 더 잘 반영하는 실험 조건이 수립되어야 할 것이다.