Developing and optimizing allele specific antisense oligonucleotide for KCNQ4-related autosomal dominant hearing loss

Abstract

Hearing loss is the most common sensory organ disorder. Genetic mutations are a significant cause of hearing loss, with over 150 genes identified as causative when mutated. KCNQ4, a voltage-gated potassium channel, is highly expressed in cochlear outer hair cells, and mutations in KCNQ4 have been reported to cause progressive hearing loss (DFNA2), making it the most common deafness-causing autosomal dominant gene among East Asians. Among the many pathogenic mutations in KCNQ4 responsible for hearing loss, KCNQ4 p.W276S (c.G827C) mutation is one of the frequent dominant-negative mutations associated with DFNA2. Despite this prevalence, there is no effective biological treatment for KCNQ4-associated hearing loss, highlighting an imperative clinical need for novel therapeutics. Here, we employed allele-specific antisense oligonucleotides (ASO) to target and develop novel therapeutics for the dominant- negative KCNQ4 mutation. Through in vitro screening, we identified that two out of the nine ASOs (ASO-123 and -127) selectively targeted the mutant mouse Kcnq4, while sparing the WT, in a dose-dependent manner. Considering toxicity profiles, we selected ASO-123 as the final candidate. For the in vivo experiment, we generated a Kcnq4 p.W277S knock-in mouse harboring a homologous mutation to human KCNQ4 p.W276S. This model successfully recapitulated progressive hearing loss and deterioration of outer hair cells, particularly at high frequencies. NGS and RT-PCR of ASO-123 injected cochleae in Kcnq4 p.W277S heterozygous mutant mice indicated preferential knockdown of mutant transcripts over wild-type, while the injection in wild-type mice did not induce hearing loss, suggesting the safety of ASO-123. Serial audiological tests corroborated the observed efficiency in transcript levels, mitigating progressive hearing loss up to 7 weeks post-injection with improved survival and function of outer hair cells. Transcriptomic analyses further validated the therapeutic efficacy and safety of ASO-123 in the inner ear. Our findings suggest that tailored ASO targeting a dominant-negative mutation can ameliorate progressive hearing loss. Further optimization is expected to increase safety and the potential for clinical translation.

난청은 가장 흔한 감각기 질환이며 유전적 요인은 난청의 발병 원인 중 큰 부분을 차지하고 있다. KCNQ4는 전위의존성 칼륨채널로 내이의 외유모세포에서 높게 발현하는 유전자이며 동아시아에서 상염색체 우성 형태로 발병하는 유전성 난청의 중요한 원인 유전자로 알려져 있고 돌연변이가 발생할 시 상염색체 우성 진행성 난청 (DFNA2)를 일으키는 것으로 알려져 있다. 난청과 연관된 많은 KCNQ4 변이 중 KCNQ4 p.W276S (c.G827C) 변이는 dominant-negative 효과로 난청을 일으키는 것이 알려져 있으며 KCNQ4 채널 내에서 돌연변이가 호발하는 hot spot region에 위치한 변이이다. 이처럼 KCNQ4로 인한 난청은 유병율이 높지만 현재까지 효과적인 생물학적 치료 방법이 개발되지 못하였다. 이에 본 연구에서는 KCNQ4의 dominant-negative 효과를 보이는 돌연변이를 타겟으로 하는 대립유전자 특이적인 안티센스 올리고핵산 (Antisense oligonucleotides, ASO) 치료제를 개발하고 최적화하고자 하였다. 우선 사람의 KCNQ4 p.W276S 변이에 상동하는 마우스의 Kcnq4 p.W277S 변이를 타깃으로 하는 9종류의 대립유전자 특이적인 안티센스 올리고핵산 치료제를 디자인하였고 이들의 효과를 세포 수준에서 확인하였다. 이를 통해 두종류의 ASO를 후보 물질로 선정하고 이들의 농도 의존적인 효과 및 독성유발 가능성 평가를 통하여 한 종류의 ASO (ASO-123)을 동물실험을 위한 물질로 최종 선정하였다. 선정된 ASO는 Kcnq4 p.W277S 변이를 이형접합으로 가지는 마우스에서 생후 1-3일 사이에 정원창을 통해 주입하였고 약 4주후에 Kcnq4 p.W277S 돌연변이를 가진 대립유전자의 발현이 정상 대립유전자 대비 통계적으로 유의하게 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 유전자 수준에서 발현 조절은 ASO 주입하고 약 7주후까지 청력검사 상에서 지연성 난청을 완화시키는 결과를 보였고 외유모세포의 생존 및 전기생리학적 기능이 개선되는 것을 확인하였다. 본 연구 결과는 유전성 난청 동물모델에서 대립유전자 특이적인 ASO 치료전략의 효용성을 종합적으로 평가한 최초의 연구로 추후 최적화 과정을 통해 실제 사람에서 난청 치료에 ASO가 이용될 수 있다는 가능성을 제시하였다.