Immune profiling of peripheral blood NKG2D+ cytotoxic lymphoid cells reveals systemic immune shifts in active alopecia areata

Abstract

Alopecia areata (AA) is a chronic autoimmune disease characterized by recurrent hair loss due to the breakdown of immune privilege in hair follicles. This breakdown leads to the expression of Natural Killer Group 2 member D (NKG2D) ligands (e.g.ULBP3), which cause immune-mediated follicular attack. Among immune cells, NKG2D+ CD8+ T cells play a key pathogenic role in AA, as demonstrated in mouse models. While these cells are also implicated in human AA, differences in NKG2D expression make the role of these cells remain elusive. Recent studies suggest that AA involves systemic immune dysregulation beyond skin, with inflammatory signals in affected skin correlating with those in blood. Some studies have reported increased expression of NKG2D in lymphoid cell subsets, including CD4+ and CD8+ T cells as well as CD56+ NK cells, in the blood of AA patients compared to healthy controls. Environmental triggers such as vaccinations, viral infections, and allergies have been associated with disease aggravation, suggesting a shift in systemic immune alteration rather than direct effect on skin. From this background, it was hypothesized that NKG2D+ cells in human blood would show immune shifts between different AA disease states, requiring a high-resolution evaluation of these cells. Also, since NKG2D has different features in human compared to animals, evaluation on NKG2D+ cells was required. To investigate changes in NKG2D+ cells and their correlation with disease severity and activity in AA, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected from patients and analyzed for NKG2D+ lymphoid subsets, including CD4, CD8, NK (CD3−, CD56+), and CD3+CD56+ cells. The proportions of each subset, as well as NKG2D+ cells, showed no significant differences between AA patients and healthy controls, and no correlation with disease severity or activity was observed. Given the interpersonal variation in immune cell composition, a paired analysis was conducted using samples from individual patients in active and stable disease states. NKG2D+ cells were sorted and analyzed using single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to enable a higher-resolution characterization of immune changes. Among the four major lymphoid subsets (CD8+ T cells, NK cells, mucosal-associated invariant T (MAIT) cells, and γδ T cells), an increased proportion of NKG2D+ NK cells and a decreased proportion of NKG2D+ CD8+ T cells were identified in the active disease state. Notably, cytotoxic CD8+ T cell subsets (GZMK+ and GZMB+) were enriched during active disease. Unsupervised differential abundance analysis using MILO further confirmed the increase of GZMK+ T cells. These changes were validated by flow cytometry, which revealed a specific increase in GZMK+ Temra cells. Transcriptomic analysis indicated enhanced activation and cytotoxicity of T cells in the active phase. Upstream regulator analysis using Ingenuity Pathway Analysis (IPA) identified cytokines as potential drivers of these changes. However, subsequent evaluation of cytokine levels by ELISA and bulk RNA sequencing of blood monocytes did not reveal significant differences between disease states. In conclusion, while the overall proportions of NKG2D+ lymphoid cells did not differ significantly between AA patients and healthy controls, a more detailed analysis revealed shifts toward cytotoxic T cell and NK cell expansion in active AA. Although cytokines were identified as potential upstream drivers of the immune shift, no significant differences were observed in serum cytokine levels or in the activity of cytokine-producing innate immune cells. These findings suggest the possibility of a tissue-originated signal; however, further investigation is required to elucidate the underlying source of immune modulation. 원형탈모(alopecia areata, AA)는 반복적인 모낭의 면역관용 붕괴로 인해 발생하는 만성 재발성 자가면역 질환이다. 면역관용의 붕괴는 NKG2D 리간드들의 발현으로 이어지며, 면역세포들의 공격으로 이어진다. 원형탈모의 병인 세포로는 NKG2D+ CD8 T 세포가 알려져 있으며, 이는 주로 마우스 모델을 통해 밝혀졌다. 인체에서도 NKG2D+ CD8+ T 세포의 역할이 확인되었으나, 인간과 동물 간 NKG2D 발현 양상의 차이가 존재하여 추가적인 연구가 필요하다. 최근 연구들은 원형탈모가 단순히 모낭에서 국한된 변화가 아니라 전신적인 면역체계 변화와 연관된 질환임을 밝혀지고있다. 선행 연구에서 혈액 내 면역학적 변화를 확인하였으며, 이러한 혈액내 변화가 두피의 변화와 상응 한다는 결과가 보고 되었다. 다른 연구에서는 건강한 대조군과 비교했을 때 원형탈모 환자의 혈액 내 NKG2D+ CD4+, CD8+, NK 세포 비율 변화를 관찰하였다. 또한 백신 접종, 바이러스 감염, 알레르기 등의 환경적 요인이 원형탈모의 임상 양상에 영향을 미칠 수 있음이 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 혈액 내 NKG2D+ 세포가 원형탈모의 임상적 경과에 따라 면역학적 변화를 보일 것이라 가정하고, 보다 정밀한 수준에서 이들 세포를 규명하고자 하였다. 또한, 기존 연구들에서 혈액내 면역세포의 임상적 특징과의 관련성은 명확히 밝혀지지 않았으므로, 이와의 관련성을 평가하고자 하였다. 먼저, NKG2D+ 세포의 발현과 원형탈모의 중증도 및 활성도와의 관련성을 확인하기 위해 건강한 대조군과 비교하여 말초혈액 단핵세포(PBMC) 내 면역세포를 분석하였다. CD4+, CD8+, NK (CD3- CD56+), CD3+CD56+ 세포군으로 나누어 비교했으나, 원형탈모 환자군과 건강한 대조군 간 유의미한 차이는 확인되지 않았으며, NKG2D+ 세포의 비율 또한 질환의 중증도나 활성도와 관련성이 없었다. 면역세포의 개인차를 고려하여, 후속 연구에서는 동일한 환자의 활성기와 안정기 상태를 비교하는 paired 분석을 진행하였다. NKG2D+ 세포에 초점을 맞춰 단일세포전사체 분석(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)을 수행한 결과, 혈액 내 NKG2D 발현 세포는 CD8+ T 세포, NK 세포, 점막연관불변T(MAIT) 세포, γδ T 세포의 네 가지 주요 세포군으로 구성됨을 확인하였다. 원형탈모 활성기에서는 NKG2D+ 세포 중 NK 세포의 비율이 증가하고 CD8+ T 세포의 비율이 감소하는 경향을 보였다. CD8+ T 세포 내에서는 특징적으로 세포독성을 나타내는 GZMK+ 및 GZMB+ CD8+ T 세포가 활성기에 증가하였다. 이러한 변화는 MILO를 이용한 차등 풍부도 분석 (differential abundance) 에서도 확인되었으며, 유세포분석에서도 일관된 결과를 보였다. T 세포의 전사체 변화를 경로 분석(pathway analysis)을 통해 확인한 결과, 활성화 및 세포독성이 증가한 것으로 나타났다. T 세포의 변화를 유도하는 요인을 규명하기 위해 Ingenuity Pathway Analysis (IPA)를 이용한 상위 신호 분석을 수행한 결과, IL-15와 같은 사이토카인이 주요 조절자로 확인되었다. 그러나 ELISA를 통한 사이토카인 정량분석과 단핵구의 RNA 시퀀싱를 진행한 결과, 이러한 상위조절자의 활성기와 안정기 간 유의미한 차이는 확인되지 않았다. 본 연구를 통해 NKG2D+ 림프구의 전체적인 비율은 원형탈모 환자와 건강한 대조군 간, 그리고 질병의 중증도 및 활성도와의 관련성에서 유의미한 차이를 보이지 않았다. 그러나 단일세포전사체 분석을 통해 질병 활성기에 따라 특정 면역세포군의 비율이 변화하는 양상을 새롭게 확인하였다. 특히, NKG2D+ CD8+ T 세포의 비율이 감소하는 반면, 세포독성을 지닌 CD8+ T 세포가 증가하는 특징이 확인되었다. 다만, 이러한 면역변화를 유도하는 상위 조절자로 확인된 사이토카인의 활성기 혈액 내 증가는 확인되지 않았다. 따라서, 향후 추가 연구를 통해 혈액내 면역학적 변화를 유도하는 기전을 규명할 필요가 있을 것으로 생각된다.