Unravelling Therapeutic Potential of Wnt Signaling in LMNA Mutation-Associated Cardiac Laminopathy

Abstract

Dilated cardiomyopathy (DCM) is the most common heritable form of cardiomyopathy and the leading cause of sudden cardiac arrest. To date, over 50 genes have been linked to DCM, Lamin A/C (LMNA) being the most significantly associated, accounting for 10% of cases. It is known that the Wnt signaling pathway is decreased in laminopathy, but the direct relationship between LMNA variants and Wnt signaling is not fully elucidated. To address this, we generated cardiac laminopathy model by introducing LMNA knockout (LMNA KO) into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using the CRISPR/Cas9 system. These modified cells were differentiated into cardiomyocytes (hiPSC-CMs) for further detailed structural and functional analyses. Deformed nuclei were observed in LMNA KO CMs, and knock-out was confirmed using immunocytochemistry, qRT-PCR and western blot analyses. Functional analyses were conducted through Multi-electrode array (MEA) and calcium transient assays revealing abnormal phenotypes in the LMNA KO CMs compared to wild-type hiPSC-CMs. In the MEA data, a reduction in spike amplitude was observed, along with frequent occurrences of arrhythmic beats. Also, calcium transient assays showed a decrease in systolic calcium and an extended time to baseline in LMNA KO CMs. RNA-seq analysis identified reduced cardiomyocyte maturation markers and highlighted diminished Wnt signaling, which was validated by immunofluorescence and Western blot analyses. To evaluate the therapeutic potential of Wnt activation, further testing was performed to characterize the cardiomyopathy phenotype after Wnt treatment using MUSCLEMOTION-based contraction analysis, MEA, and calcium transient assays. Wnt activators partially alleviated irregularities, improved spike amplitude, normalized E-C delays, and significantly reduced the percentage of proarrhythmic cells. Structural analysis revealed partial restoration of damaged sarcomeres. Additionally, cell cycle analysis demonstrated premature characteristics of LMNA KO CMs, and Wnt activation promoted cell cycle re-entry by expanding the S phase, correlated with increased Akt phosphorylation. To investigate whether Wnt activators have therapeutic potential for other DCM-associated mutations, we used TBL1X KI cardiomyocytes. However, Wnt activation had minimal ameliorative effects on TBL1X KI hiPSC-CMs, another DCM patient variant. In conclusion, this study unravels that decreased Wnt signaling contributes to the pathogenesis of cardiac laminopathy and that Wnt activators may offer therapeutic benefits in LMNA mutation-associated cardiac laminopathy by reactivating the cell cycle in prematurely arrested cardiomyocytes. 확장성 심근병증(DCM, Dilated Cardiomyopathy)은 가장 흔한 유전성 심장 질환이며, 급성 심정지의 주요 원인입니다. 현재까지 50개 이상의 유전자가 확장성 심근병증과 연관된 것으로 확인되었으며, 그중 Lamin A/C (LMNA) 유전자는 10%의 사례를 차지하며 가장 밀접한 연관성을 보입니다. 라민병증(laminopathy)에서 Wnt 신호전달 경로가 감소한다는 것은 알려져 있지만, LMNA 변이와 Wnt 신호전달 간의 직접적인 연관성은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이를 규명하기 위해, 본 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여 사람 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)에 LMNA 유전자 결실(knockout)을 도입하여 심장 라민병증 모델을 제작하였습니다. 이러한 변형된 세포를 심근세포(hiPSC-CMs)로 분화시켜 정밀한 구조적 및 기능적 분석을 수행하였습니다. LMNA 결실 심근세포에서는 변형된 핵이 관찰되었으며, 면역세포화학, qRT-PCR, 웨스턴 블롯 분석을 통해 유전자 결실이 확인되었습니다. 기능 분석은 다중 전극 어레이(Multi-electrode array, MEA) 및 칼슘 흐름 분석(calcium transient assay) 을 통해 수행되었으며, LMNA 결실 심근세포가 정상 심근세포와 비교하여 비정상적 표현형을 보이는 것이 확인되었습니다. 다중 전극 어레이 데이터를 통해 스파이크 진폭(spike amplitude)의 감소와 빈번한 부정맥 박동(arrhythmic beats)이 관찰되었습니다. 또한, 칼슘 흐름 분석에서는 수축기 칼슘의 감소와 기저선으로 돌아가는 시간(time to baseline)의 연장이 확인되었습니다. 전사체 분석을 통해 심근세포 성숙 마커의 감소가 확인되었으며, Wnt 신호전달의 감소가 강조되었습니다. 이러한 결과는 면역형광 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 검증되었습니다. Wnt 활성화의 치료적 가능성을 평가하기 위해 MUSCLEMOTION, 다중 전극 어레이, 및 칼슘 흐름 분석을 사용하여 심근병증의 정밀 표현형 분석을 수행하였습니다. Wnt 활성화제를 사용한 결과, 불규칙성이 부분적으로 완화되고, 스파이크 진폭이 개선되었으며, 연장된 E-C 지연(E-C delay)이 정상 상태로 돌아가는 것이 확인되었습니다. 유사하게, 칼슘 흐름 분석에서는 부정맥 세포의 비율이 유의미하게 감소하였으며, 전반적인 지표가 정상 수준으로 복귀하였습니다. 또한, 구조 분석을 통해 LMNA 결실 심근세포에서 손상된 근육원섬유(sarcomere)의 구조가 부분적으로 회복된 것이 관찰되었습니다. 세포 주기 분석에서는 LMNA 결실 심근세포의 미성숙(premature) 특성이 확인되었으며, Wnt 활성화가 S기(S phase)를 확장시켜 세포 주기 재진입을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 이는 Akt 인산화가 증가한 결과와 상관관계를 보였습니다. 한편, 또 다른 확장성 심근병증 환자 변이인 TBL1X KI 심근세포에 Wnt 활성화제를 처리하였을 때는 효과가 미미한 것으로 나타났습니다. 결론적으로, 본 연구는 감소된 Wnt 신호전달이 심장 라민병증 병인에 기여한다는 것을 규명하였으며, Wnt 활성화제가 미성숙한 심근세포의 세포 주기 재활성화를 통해 LMNA 변이와 관련된 심장 라민병증에 치료적 혜택을 제공할 가능성을 제시합니다.