Functional validation for TNNT2 variants using patient specific iPSC-derived cardiomyocyte in dilated cardiomyopathy

Abstract

Dilated cardiomyopathy (DCM) represents a subset of non-ischemic heart failure, characterized by enlarged and poorly contractile ventricles. Approximately 30-50% of DCM are hereditary, with variant in the TNNT2 gene linked to the condition. While TNNT2 variants are implicated in DCM, their pathogenic classification often remains uncertain due to a lack of functional validation. Patient-derived induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes (CMs) recapitulate key aspects of cardiac contractility and electrophysiology, providing a physiologically relevant platform for in vitro modeling of cardiomyopathies. This study aimed to obtain functional validation for specific TNNT2 variants in DCM patients by utilizing human iPSC-CMs. Among DCM patients who underwent genetic testing at a tertiary hospital between January 2017 and March 2020, several TNNT2 variants were identified, including both likely pathogenic variant and variant of uncertain significance (VUS). iPSCs were generated from a 34-year-old male patient diagnosed with DCM, carrying a missense variant in TNNT2 p.Arg205Trp (R205W), which was classified as likely pathogenic, and from a 56-year-old male patient diagnosed with DCM, carrying a missense variant TNNT2 p.Lys210Met (K210M), which was classified as VUS. Control iPSCs obtained from a stem cell bank were used for comparison. These iPSCs were differentiated into cardiomyocytes and analyzed for variant-specific alterations in electrophysiological properties and calcium handling. Electrophysiological properties using multi-electrode arrays (MEA) and spontaneous Ca2+ transients were analyzed for both iPSC-CMs. CRISPR-Cas9-mediated gene editing was applied to generate isogenic controls and assess the reversibility of observed phenotypes. The generated iPSCs expressed stem cell markers and differentiated into cardiomyocytes. Compared to the control iPSC-CMs, R205W iPSC-CMs exhibited shorter sarcomere lengths, higher spontaneous beating rates, lower contractility, and slower propagation velocity, as determined by MEA analysis. In contrast, K210M iPSC-CMs exhibited no significantly different findings in MEA analysis compared to the control iPSC-CMs. Additionally, Ca2+ transient analysis showed lower systolic Ca2+ and amplitude in R205W iPSC-CMs, indicating impaired Ca2+ handling. Following CRISPR-Cas9-mediated correction of R205W variant to the wild-type TNNT2 sequence, functional assays demonstrated a reversal of the previously observed phenotypic abnormalities, including improvements in electrophysiological parameters and Ca2+ transients. In this study, patient-specific iPSC-CM platforms were investigated to functionally evaluate TNNT2 variants associated with DCM. The likely pathogenic variant demonstrated clear abnormalities in electrophysiology and Ca2+ handling, which were reversed through CRISPR-Cas9-mediated gene correction, supporting its causal role in disease. In contrast, a nearby variant classified as a VUS showed no significant functional alterations, underscoring the specificity and discriminative power of this model. These findings highlight the value of iPSC-CM-based functional assays for the clinical interpretation of sarcomeric gene variants. 본 연구는 확장성 심근병증(Dilated Cardiomyopathy, DCM)과 관련된 TNNT2 유전자 변이의 병원성 평가를 위해 환자 유래 전분화능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 기반 심근세포(cardiomyocytes; CMs) 모델을 구축하고, 기능적 분석을 수행한 연구이다. DCM은 심실 확장과 수축기 기능 저하를 특징으로 하며, 약 30-50%가 유전적 요인과 연관되어 있다. 특히 TNNT2 유전자는 트로포닌 복합체 구성 요소로, 근절(sarcomere) 단백질 중 DCM과 연관된 대표 유전자 중 하나이나, 그 변이에 대한 기능적 데이터는 제한적이며, 그 중 많은 변이들이 임상적 의의가 불확실한 변이(Variants of Uncertain Significance; VUSs)로 분류되어 있다. 본 연구에서는 TNNT2 변이를 가진 환자 2명을 대상으로 각 변이(p.Arg205Trp; R205W, p.Lys210Met; K210M)에 대해 iPSC를 제작하고, 이를 심근세포로 분화시켜 기능 분석을 수행하고자 하였다. 연구 대상 환자는 DCM 코호트 내에서 시행한 유전체 분석 선별을 통해 선정하였다. TNNT2 변이를 지닌 환자들 중, 병원성이 확실시되거나, VUS 중에서도 병원성이 의심되지 않는 변이들은 제외하였고, 각각 likely pathogenic 및 VUS 로 분류된 TNNT2 변이(각각 R205W, K210M)를 연구 대상 변이로 선정하였다. 기능적 변화를 검증하기 위해, 2017년에 한국줄기세포은행에 보관된 CMC-iPSC-011 계열의 건강한 공여자로부터 유래한 iPSCs(이하, 대조 세포주)를 사용하였다. R205W, K210M 변이를 지닌 환자 혈액으로부터 제작된 iPSC와 대조 세포주로부터 표준화된 심근세포 분화 프로토콜을 통해 iPSC-CM가 유도되었고, pluripotency marker 및 sarcomere 단백질(cTnT, titin, α-actinin) 발현을 확인하였다. 변이의 기능적 분석을 위해 전기생리학적 측정(multi-electrode array; MEA), 칼슘 흐름 분석, sarcomere 길이 측정 등을 수행하였다. 또한 R205W 변이에 대해서는 CRISPR-Cas9 기반 유전자 교정을 수행하여 wild-type으로 복구된 isogenic 세포주(R205WCorr)를 구축하였으며, 동일한 분석 방법으로 기능적 비교를 수행하고자 하였다. R205W 변이를 가진 iPSC-CMs는 대조 세포주 심근세포와 비교하여 빠른 박동률, 낮은 수축력, 느린 전도 속도, 그리고 칼슘 유입 및 배출의 이상을 보였으며, action potential duration(APD) 또한 비정상적으로 짧아지는 현상이 관찰되었다. 이는 iPSC immaturity에서 흔히 보이는 패턴과는 다른 결과로, 해당 변이가 전기생리학적 기능 이상을 유발함을 시사한다. 반면, K210M 변이를 가진 iPSC-CMs는 박동 주기에서만 경미한 차이를 보였고, 전도 속도나 수축력에서는 유의한 차이를 보이지 않아 기능적으로 병리성을 뒷받침하기 어려운 결과를 나타냈다. 추가적인 세포내 칼슘 흐름 분석에서, R205W 변이를 가진 iPSC 유래 심근세포에서는 대조 세포주 심근세포 대비 칼슘 신호 주기가 정상 세포에 비해 현저히 짧았으며, 수축기 칼슘 신호의 진폭 또한 유의하게 감소한 양상을 보였다. 이러한 변화는 심근세포 내 칼슘 조절 기능의 장애를 반영하며, 수축기 기능 저하와 밀접한 관련이 있는 것으로 생각되었다. R205W 변이에 대해 CRISPR-Cas9 방법을 통해 wild-type으로 교정하였을 때 해당 변화가 어떻게 다시 달라지는지 확인하고자 하였고, 유전자 교정을 통해 복구된 R205WCorr iPSC-CMs에서는 이러한 기능적 변화가 대부분 정상화되어, R205W 변이의 병인성을 지지하는 강력한 근거를 제시하였다. 이러한 결과는 DCM 환자를 대상으로 한 TNNT2 유전자 변이의 기능적 영향에 대한 정량적 비교 및 교정 후 회복 효과를 최초로 보고한 사례로, 특히 VUS 변이의 기능적 평가에 대한 새로운 가능성을 제시하였다. 이를 통해 R205W 변이는 sarcomere 구조 및 칼슘 조절에 영향을 주며, 이는 DCM에서 중심적인 병태생리인 수축기능 저하와 밀접히 연결된다는 것을 알 수 있었다. iPSC-CM 기반의 기능 분석 플랫폼은 향후 변이의 병원성 재분류 및 정밀 유전 진단에 있어 중요한 역할을 할 수 있으며, 유전자 기반 맞춤 치료 전략 수립을 위한 기반 연구로서 의의가 크다고 할 수 있겠다.