Increased bio-stability and efficacy through surface modification of stem cell-derived nanovesicles drug carriers

Abstract

Many studies have suggested that nanoparticles, such as liposomes and nanovesicles (NV), may be used as a therapeutic. However, there are challenges regarding in-vivo stability and particle stability. Therefore, PEGylation is emerging as a method for improving the stability of internal and nanoparticles. In order to be used as a therapeutic by applying the method, the PEG quantification shall be made before commercialization. Nanoparticles such as liposomes are made up of synthetic polymers, and they are easy to analyze using high performance liquid chromatography (HPLC) and gel permeation chromatography (GPC) as the compounds added to produce nanoparticles are well known. However, stem cell-derived nanoparticles consist of many compounds, such as protein and RNA, making it difficult to analyze their chemical properties due to the presence of complex recognition signals. However, information about PEG quantification is still insufficient. Thus, this study aims to investigate the methodology for PEG quantification per particle. This study found that the high shear-rate dispersion method can produce PEGylation in large quantities using nanovesicle and suggested that PEG quantitative analysis method using produced PEGylated NV produced by the method. PEGylated NV produced by the method can be quantitatively and consistently controlled according to the displayed PEG concentration per particle. However, there are difference types of critical points that can be maximum displayed depending on the lipid-PEG type. Therefore, this study compared the difference between PEGylation critical points according to PEG based on two lipid types and the stability of particles according to the PEG density of the particle surface. DMG-PEG2000 (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000) displayed efficiency was about 20 times higher than DSPE-PEG2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-amino (polyethylene glycol)-2000), and the particle stability increased as PEGylation increased. This study also verified that PEGylation could be used as a targeted therapeutic of NV through validation evaluations as it synthesis target material of the distal ends of PEG chains. When a targeting peptide is displayed on PEGylated NV, target efficiency to lesions is increased; therefore, it can be used as a more effective drug delivery system. For example, therapy efficiency can be improved by increasing the mucosal permeability of the organ when using a PEGylated NV. DMG-PEG has higher PEGylation efficiency and hydrophilic than DSPE-PEG, and the advantages may vary depending on the purpose of the therapy. Therefore, further research is required to identify the chance of circulation time according to PEG density and patterns of cellular uptake depending on indications and to optimize the PEGylation density through in-vitro and in-vivo efficiency evaluation. This study increases the biostability using PEGylation of human-friendly stem cell-derived NV and suggests a quantitative analysis method and critical point of PEGylation according to lipid-PEG types. Furthermore, we could confirm through validation that the medicinal effect of NV can be improved by displaying peptide on distal ends of PEG chains. Also, we could identify through the in-vivo that the therapeutic effect can be increased as PEG helps the adsorption of NV in the mucous membrane. These results indicate that cell-derived NV may be surface modification depending on the site and purpose of therapy, and quantitative analysis is possible.

리포좀, 나노베지클을 비롯한 나노파티클은 입자 안정성, 체내 안정성을 향상시키기 위한 방법으로 페길화가 제시되었고 활발한 연구가 이루어지고 있다. 이 방법을 적용하여 치료제로 상용화하기 위해서는 전시된 PEG의 양을 정량화 하여야 한다. 합성고분자로 이뤄진 리포좀과 같은 나노파티클은 제조 시 첨가된 합성물을 정확하게 알고 있어 HPLC, GPC와 같은 분석을 적용하기 쉬우나 줄기세포 유래 나노파티클은 단백질, RNA 등으로 입자를 구성하고 있는 성분이 많아 화학적 분석 시 복잡한 시그널이 확인되어 같은 방법을 적용하기 어렵다. 그렇기 때문에 줄기세포 유래 나노파티클을 페길화하여 연구한 기존 문헌에서는 입자 당 전시된 PEG를 정량화 한 내용을 찾기 힘드나 본 연구에서는 이를 정량화 할 수 있는 분석 방법을 개발하였다. 본 연구에서는 나노베지클을 페길화하면서 대량 생산할 수 있는 방법인 고전단율 유체분산 방법을 고안하고 해당 방법을 통해 제조된 페길화 나노베지클의 페길화 된 PEG의 정량적 분석법을 제안하였다. 개발한 방법으로 제조된 페길화 나노베지클은 입자 당 전시된 PEG를 농도에 따라 정량적, 일관적으로 조절할 수 있다. 하지만 PEG에 접합된 지질의 종류에 따라 최대로 전시가능한 임계점이 존재하며 2가지 지질 종류의 PEG에 대한 페길화 임계점과 입자 표면의 PEG 밀도에 따른 입자 안정성의 차이를 비교하였다. DSPE-PEG보다 DMG-PEG의 전시 효율이 약 20배 정도 높았으며 입자안정성도 페길화 임계점과 함께 증가하는 것을 확인하였다. 페길화의 또 다른 강점으로는 PEG 말단에 표적 물질을 합성하여 나노베지클의 표적 치료제로서 역할을 부여한다는 것을 유효성 평가를 통해 검증하였다. 페길화 나노베지클에 표적 펩타이드를 전시할 경우 세포 흡수가 증가하여 보다 효과적인 약물전달체로 이용될 수 있다. 활용 예로 페길화 나노베지클을 이용하면 장기 점막 투과성을 증진시켜 치료효과를 개선시킬 수 있다. DMG-PEG가 DSPE-PEG보다 페길화 효율과 임계점이 높았으며 치료제의 목적에 따라 장점이 달라질 수 있다. 추가 연구로는 PEG 밀도에 따른 체내 순환시간의 변화, 적응증 별 세포 흡수 양상, 적응증 별 in-vitro와 in-vivo 유효성 평가에 따른 페길화 밀도 최적화가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 인체 친화적인 줄기세포 유래의 나노베지클을 페길화하여 생체안정성을 증대하고 PEG에 접합된 지질의 종류에 따른 페길화 임계점과 정량적 분석법을 제시한다. 나아가 PEG 말단에 펩타이드를 전시하여 나노베지클의 약리효과가 증대될 수 있음을 유효성을 통해 확인하였다. 또한 PEG 접합 지질의 특성에 따라 페길화의 임계점이 달라질 수 있는 것을 확인하였다. 이 연구 결과는 줄기세포 유래 나노베지클도 치료 부위와 목적에 따라 표면 개질이 가능하고 정량적 분석이 가능하다는 것을 시사한다.