Creating a model of PCDH19-related epilepsy syndrome using the Xenopus tropicalis and investigating the association of GABA-A signaling

Abstract

PCDH19-related epilepsy syndrome is a rare disorder characterized primarily by epilepsy onset before the age of 3, developmental delay, intellectual disability, autistic tendencies, and behavioral abnormalities. The causative gene, PCDH19, encodes a calcium-dependent single-pass transmembrane protein known as protocadherin-19. This protein plays a crucial role in neural development by regulating cell-to-cell adhesion through homophilic binding via its extracellular cadherin domains and modulating inter-neuronal signaling. The PCDH19 gene is located on the X chromosome. While males with mutations typically do not manifest the disease, 90% of females with a mutation on one of their two X chromosomes exhibit female-limited epilepsy. This is attributed to random X-chromosome inactivation, leading to a mosaic pattern of normal and PCDH19-mutated cells, causing abnormal cellular interference. Recent findings have also revealed that PCDH19 interacts with the alpha1 subunit of the GABA-A receptor in neurons, and by modulating the expression of PCDH19, the GABAergic neurotransmission signal of the GABA-A receptor can be regulated. In this thesis, using the Xenopus tropicalis model, I conducted loss-of-function experiments using PCDH19 morpholinos to create a model of PCDH19-related epilepsy syndrome. I then quantified changes in the epilepsy phenotype of Xenopus tropicalis induced by GABA-A agonists and antagonists to determine if the behavioral phenotype caused by PCDH19 deficiency can be alleviated through GABA-A signaling modulation. By microinjecting PCDH19 morpholinos into Xenopus tropicalis embryos, I suppressed PCDH19 gene expression specifically in the central nervous system, induced functional loss, and conducted behavioral tests to quantify the manifestation of PCDH19-related epilepsy. The microinjection was differentiated between 8-cell and 16-cell stages, with the 8-cell stage embryos receiving injections in all cells for complete knockdown and the 16-cell stage embryos receiving injections in only half of the cells to induce a mosaic pattern. The study contrasted the differences between the mosaic pattern and complete knockdown in the central nervous system. While there were no morphological changes in the developing embryos from either group, both exhibited abnormal swimming trajectories and typical epileptic behaviors, including seizures and abnormal behaviors. Detailed analysis and quantification of these behaviors were conducted, and treatment with the antiepileptic drug potassium bromide reduced the frequency and duration of seizures, confirming the behaviors as epileptic. Furthermore, cryosections of Xenopus tropicalis brains during the peak of PCDH19 expression revealed that while control group brains had a scattered distribution of morpholino-injected and non-injected cells, PCDH19 knockdown cells clustered together. After inducing the epilepsy phenotype in Xenopus tropicalis embryos with PCDH19 morpholino injections, treatment with the GABA-A agonist Muscimol and antagonist Bicuculline during the formation of the central nervous system showed that Bicuculline-treated individuals had relatively reduced seizure behaviors, while Muscimol-treated individuals exhibited increased seizure behaviors. These findings underscore the significance of PCDH19 as a key regulator of GABAergic neurotransmission and provide theoretical evidence for understanding the novel pathogenesis mechanism of PCDH19 epilepsy.

PCDH19 관련 뇌전증 증후군은 주로 3세 이전에 발병하는 뇌전증과 발달 지연, 지적 장애, 자폐 성향, 행동 이상을 주 증상으로 하는 희소 질환이다. 원인 유전자인 PCDH19는 protocadherin-19이라는 칼슘 의존적 단일 투과막 단백질을 암호화하는데 이는 세포 외 캐드헤린 도메인을 통한 동종친화성 결합에 의한 세포-세포간 접합과 뉴런 간의 신호전달을 조절하여 신경의 발생에 중요한 역할을 한다. PCDH19 유전자는 X염색체에 있으며 남성의 경우 돌연변이가 있어도 보통 발병하지 않으나 두 X염색체 중 하나에서 돌연변이를 가지고 있는 여성의 경우 90%에서 여성 제한적 뇌전증이 발병한다. 이는 X염색체의 무작위적 불활성화로 인한 정상세포와 PCDH19 돌연변이 세포의 모자이크 현상에 의한 세포 간의 비정상적인 간섭을 유발함으로써 발생한다. 또한 최근 PCDH19가 GABA-A 수용체의 alpha1 소단위를 통해 신경세포에서 결합하여 상호작용을 하며 PCDH19의 발현을 인위로 조절해줌으로써 GABA-A receptor의 GABAergic 신경전달 신호를 조절할 수 있음이 밝혀졌다. 이 학위 논문에서는 Xenopus tropicalis 모델을 이용하여 PCDH19 모폴리노를 이용한 기능 상실 실험을 진행하여 PCDH19 관련 뇌전증 증후군 모델을 제작하고 뇌전증 표현형을 가지는 Xenopus tropicalis의 GABA-A 작용제와 길항제에 의한 표현형의 변화를 정량 함으로써 PCDH19 결핍에 의한 행동표현형을 GABA-A 신호 조절을 통해 완화할 수 있는지 규명하고자 하였다. Xenopus tropicalis의 배아에 미세주입법을 통해 PCDH19 모폴리노를 주입하여 PCDH19 유전자의 발현을 중추신경계 특이적으로 억제, 기능 손실을 유도하고 행동검사를 실시하여 PCDH19 관련 뇌전증의 행동적 표현형이 나타나는지 뇌전증의 대표적인 증상인 발작의 수를 계산 및 집계하여 정량적인 분석을 진행했다. 미세주입법 시 주입 시기를 8세포기와 16세포기로 나눠 8세포기의 배아는 중추신경계로 분화하는 모든 세포에 주입하여 전체 녹다운을 통한 기능 손실을 유도하고 16세포기의 배아에는 중추신경계로 분화하는 4개의 세포 중 절반인 2개의 세포에만 주입하여 모자이크 현상을 통한 기능 손실을 유도하여 두 실험군 간의 대조를 통하여 중추신경계에서의 모자이크 현상과 전체 녹다운 개체 간의 차이를 분석하였다. PCDH19의 중추신경계 특이적 전체 녹다운과 모자이크 현상 녹다운은 발생 중인 배아의 외형적 형태학상의 변화를 일으키지 않았으나 두 실험군 모두에게서 비정상적인 헤엄 궤도와 뇌전증의 대표적인 증상인 발작행동 및 이상행동이 나타났다. 발작행동 및 이상행동을 세부적으로 분석 및 정량화 하기 위하여 발작행동으로 예측되는 6가지의 기준을 설정하여 행동의 빈도수와 시간을 집계하였고 대표적인 항경련제인 포타슘브로마이드를 약물처리 하였을 때 발작의 빈도수와 시간이 감소하였음을 통해 설정해준 6가지 기준의 행동이 발작행동임을 증명하였다. 또한 PCDH19의 발현이 가장 활발한 시기의 Xenopus tropicalis 배아의 뇌를 동결절편하여 대조염색을 통해 PCDH19이 녹다운 된 세포의 위치와 분포를 관찰한 결과 16세포기의 중추신경계에서의 모자이크 현상 녹다운을 해준 개체의 뇌에서 대조군은 모폴리노가 주입된 세포와 주입되지 않은 세포가 고르게 흩어져 산재했지만 PCDH19 녹다운 세포들이 모여서 위치함을 관찰했다. PCDH19 모폴리노의 주입 후 유도된 뇌전증 표현형 Xenopus tropicalis 배아의 중추신경계가 형성되는 시기에 대표적인 GABA-A 작용제인 Muscimol과 길항제인 Bicuculline을 처리하고 중추신경계 형성이 완료된 시기의 올챙이의 행동을 행동검사 한 결과 길항제인 Bicuculline을 처리한 개체에서는 발작행동이 상대적으로 감소하였고 작용제인 Muscimol을 처리한 개체에서는 발작행동이 상대적으로 증가하였음을 관찰했다. 위와 같은 사실을 통해 GABA 작동성 신경전달의 핵심 조절자로써 PCDH19의 중요성과 새로운 PCDH19 뇌전증의 발병 메커니즘을 이해하는데 우리에게 이론적 근거를 제시한다.