Identification of SARM1-dependent signaling mechanism in axon destruction program

Abstract

"In 1850, August Waller described the stereotypical disintegration of a distal axonal fragment separated from its cell body, which is termed Wallerian degeneration. It has only recently been established that Wallerian degeneration and disease-associated degeneration of non-severed axons, particularly dying-back axon degeneration, share the molecular mechanisms and effectors, a key molecule being SARM1. Genetic deletion of the SARM1 gene delays Wallerian degeneration, and hence current efforts are focused on whether its suppression is therapeutic in injury-induced axon degeneration, such as in chemotherapy-induced peripheral neuropathy, and disease-associated dying-back axon degeneration, such as in Parkinson’s disease and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Originally described as a Toll-like receptor adapter protein, it was recently shown that the TIR domain of SARM1 has an unexpected nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) hydrolase (NADase) activity, which is activated by dimerization and catalyzes the hydrolysis of NAD+ into nicotinamide and adenine diphosphate ribose (ADP-ribose, or ADPR) or cyclic ADPR (cADPR), making it a druggable target. Developing small molecule inhibitors of SARM1 NADase activity is an active area of research. A puzzling finding is that SARM1 proteins are present in healthy axons of all ages, ready to execute the axon destruction program when triggered by axonal injury or disease-causing intracellular stimuli. Because SARM1 activation initiates an irreversible cascade of reactions to axon degeneration, this means that SARM1 is not activated at all in most axons during the lifetime. How the activation of SARM1 is tightly controlled in normal axons is largely unknown. The aim of this thesis was to elucidate the molecular mechanisms underlying the autoinhibition and activation of SARM1 in normal and diseased axons. To achieve this, I employed the APEX2 proximity biotinylation assay to selectively isolate proteins that associate with SARM1 in healthy and injured axons. Using this technique followed by affinity purification and mass spectrometry, I identified approximately 1000 proteins that are in close proximity to SARM1 proteins in axons as well as changes in their abundance in response to axonal injury. From this dataset, I drew two main conclusions. First, I found evidence that the subcellular localization of SARM1 proteins changes in response to injury. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) revealed that the interactions between SARM1 and mitochondrial proteins decrease in response to injury. In contrast, the interactions between SARM1 and mediators of cellular stress responses and actomyosin increased in injured axons. These results suggest that inactive SARM1 proteins may be docked in mitochondria and redistributed using the actomyosin motor. Second, I found evidence that interactions between SARM1 and Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) may facilitate SARM1 activation. NAMPT converts nicotinamide to nicotinamide mononucleotide (NMN), which is known to increase SARM1 activity. I found a slight increase in interactions between SARM1 and NAMPT in injured axons, suggesting an interesting mechanism of positive feedback in SARM1 activation. In line with this idea, a newly developed small molecule inhibitor of NAMPT delayed Wallerian degeneration as well as chemotherapy-induced peripheral neuropathy. In summary, I identified proteins whose association with SARM1 proteins changes in response to axonal injury as intended and made two new findings relevant to understanding the molecular mechanisms underlying SARM1 activation and its prevention. The new dataset and findings made in this thesis will contribute to a deeper understanding of SARM1 activation in diseased and injured axons and may shed light on therapeutic strategies to prevent SARM1 activation and SARM1-dependent axon degeneration and neurodegenerative diseases.

1850년에 August Waller는 세포체에서 분리된 말단 축삭 조각의 전형적인 분해를 기술하였으며, 이를 월러변성 (Wallerian degeneration)이라고 합니다. 최근에서야 월러 변성 과 질병과 관련된 비분리된 축삭의 변성, 특히 죽어 가는 후퇴성 축삭 변성이 분자 기작과 실행자를 공유한다는 것이 확립되었습니다. 주요 분자 중 하나는 SARM1입니다. SARM1 유전자의 유전자 삭제는 월러변성을 예방하며, 따라서 현재의 노력은 화학 요법 유발 말단 축삭 변성 (예: 화학 요법 유발 말단 신경병증) 및 질병 관련 후퇴성 축삭 변성 (예: 파킨슨병 및 경도 전층 경화증)과 같은 손상 유발 말단 축삭 변성에서 그 억제가 치료적인지에 중점을 두고 있습니다. 처음에는 Toll 유사 수용체 어댑터 단백질로서 기술되었지만, 최근에는 SARM1의 TIR 도메인이 예상치 못한 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NAD+) 가수분해 효소 (NADase) 활동을 가지고 있음이 밝혀졌습니다. 이는 이성질화에 의해 활성화되며, NAD+를 니코틴아마이드와 아데닌 이인산 리보스 (ADPR) 또는 사이클릭 아데닌 이인산 리보스 (cADPR)로 가수분해하는 반응을 촉매화합니다. 이로써, SARM1은 치료 대상이 될 수 있습니다. SARM1 NADase 활동의 소분자 억제제 개발은 활발한 연구 분야입니다. 축삭 변성에 대한 명확한 역할에도 불구하고, SARM1은 건강한 축삭에서도 발견되며, 상처나 질병 발생 후에만 NADase 활동이 활성화되는 방법은 알려져 있지 않습니다. 저의 논문의 전반적인 목표는 정상 및 질병에 걸린 축삭에서 SARM1의 자가억제 및 활성화에 관여하는 단백질 후보군을 식별하고 관련된 분자 기작을 제시하는 것입니다. 이를 위해, 저는 APEX2 proximity biotinylation assay를 통해 활성화 또는 비활성화 상태에 특이적인 SARM1 상호 작용체를 분리 동정했습니다. 정상 축삭과 손상된 축삭에서 affinity purification을 하고 대량질량분석을 통해 대략 1000개의 SARM1 의존적 축삭 파괴프로그램에 관련된 단백질을 성공적으로 식별했습니다. SARM1의 활성화 및 비활성화 시 축삭에서의 상호작용체를 통해 총 2가지의 결론을 도출할 수 있었습니다. 첫째, 부상에 대한 반응으로 SARM1 단백질의 세포 내 위치가 변화하는 증거를 발견했습니다. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)에 따르면 SARM1과 미토콘드리아 단백질 간의 상호 작용이 감소합니다. 이와는 대조적으로, cellular stress responses 와 actomyosin 간의 상호 작용은 손상된 축삭에서 증가합니다. 이러한 결과는 비활성 상태의 SARM1 단백질이 미토콘드리아에 결합할 수 있으며, actomyosin 모터를 이용하여 다른 곳으로 이동할 수 있음을 시사합니다. 둘째, SARM1과 니코티나마이드 포스포리보실트랜스페라아제 (NAMPT) 간의 상호 작용이 SARM1 활성화를 촉진할 수 있다는 증거를 발견했습니다. NAMPT는 니코틴아마이드를 니코티나미드 모노뉴클레오 티드(NMN)로 변환하며, 이는 SARM1 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있습니다. 부상을 입은 축삭에서 SARM1과 NAMPT 간 상호 작용이 약간 증가한 것을 발견했는데, 이는 SARM1 활성화에 긍정적인 반응 메커니즘을 시사합니다. 이 결과와 일치하게, NAMPT의 새로운 소분자 억제제가 월러변성 및 화학 요법 유발 말단 신경병증을 지연시키는 것으로 나타났습니다. 요약하자면, 축삭 손상에 대한 반응으로 SARM1 단백질과 관련된 단백질을 식별하고 의도된 대로 그들의 상호 작용이 변하는 두 개의 새로운 발견을 하였으며, 이는 SARM1 활성화 및 그 예방을 이해하기 위한 분자 기전에 관련된 깊은 이해에 기여할 것으로 예상됩니다. 이 학위 논문에서의 새로운 데이터와 결과는 질병과 손상을 입은 축삭에서의 SARM1 활성화에 대한 깊은 이해에 기여할 뿐만 아니라 SARM1 활성화 및 SARM1-의존적 축삭 변성 및 신경퇴행성 질환을 예방하기 위한 치료 전략에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다."