Isolation and characterization of clinical RSV in South Korea and its immunogenicity evaluation methods for vaccines in development

Abstract

Respiratory Syncytial Virus (RSV) is a particularly significant viral pathogen in young children, elderly individuals, and immunocompromised adults. Most of the published researches with RSV had been performed on RSV Long and RSV A2, isolated in 1956 and 1961; nevertheless, contemporary RSV isolates are distinct from these prototype strains. These viruses have also undergone serial passages in cell culture, which may have led to modifications that impact virus-host interaction. While many new preclinical and clinical studies are under development for vaccines against RSV, up to date, no studies have established in vitro culture system and defined the immunogenicity evaluation based on contemporary clinical RSV strains in Korea. In this study, we isolated and characterized the clinical RSV strains from September 2019 to December 2022. We inoculated clinical RSV into Hep-2 cells and confirmed their characteristics with the capacity for syncytium formation by immunocytochemistry and flow cytometry. Clinical isolated RSV was successfully inoculated, and RSV-infected Hep-2 cells showed the matured and enriched syncytium in an RSV concentration-dependent manner. Moreover, we also investigated whether significant alterations occurred in the genotypic patterns of RSV strains in Korea before and after the COVID-19 pandemic, utilizing whole-genome sequencing (WGS). This prospective study was conducted at Severance Children's Hospital in Seoul, Korea from September 2019 to December 2022. WGS analysis was performed using the PacBio Circular Consensus Sequencing platform. samples were collected from 285 children, out of which RNA extracts from 155 samples (66 type-A and 89 type-B) were available for G protein genotyping and whole-genome sequencing (WGS) analysis. The G protein genotyping revealed that the most frequently identified genotypes were ON1 for RSV- A and BA9 for RSV-B. The WGS analysis showed that the genotypes clustered closely with ON1/NA1 for RSV-A and BA for RSV-B, respectively. One mutation was identified in the RSV strain that confers resistance to palivizumab. In addition, mutations associated with nirsevimab resistance were not detected. Lastly, we also document the methodology of RSV-specific serologically mediated immunogenicity evaluation by focus reduction neutralization test (FRNT). These results will provide the potential effectiveness of vaccine developments and consequently the burden resulting from RSV disease in Korea.

호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV)는 전 세계 영유아의 급성 하부 호흡기계 감염의 가장 중요하고 흔한 병원 체이다 RSV에 관련되어 발표된 연구의 대부분은 1956년과 1961년에 각각 분리된 RSV Long과 RSV A2을 사용하여 수행되었다. 이 바이러스들은 연속적으로 배양되었고 이 과정에서 바이러스와 숙주의 상호 작용에 영향을 미치는 변이를 초래했을 가능성이 있다. 현재, RSV백신 또는 치료제에 대한 비임상 및 임상 연구가 계속해서 개발되고 있지만, 현재까지 국내에서 유행하는 바이러스의 in vitro 배양 시스템을 구축하거나 이를 기반으로 면역원성 평가를 수립한 연구는 아직 없는 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 2019년 9월부터 2022년 12월까지 환자 유래RSV를 in vitro 배양 및 증식 시스템을 통해 분리 및 증식하였고 바이러스 특징을 분석 하였다. 또한, Hep-2 세포에 배양한 RSV를 접종하여 세포 면역염색법(Immunocytochemistry) 또는 유세포분석 (Flowcytometry)기법 활용하여 세포 감염률을 측정하였다. 그 결과, 환자 유래 RSV를 감염시킨 세포주에서 RSV 감염 특징인 세포병변효과 (Cytopathic effect, CPE) 와 다핵질(Syncytium)이 형성됨을 관찰할수 있었다. 다음으로, 본 연구에서는 전장유전체 분석법 (Whole genomesequencing, WGS)를 활용하여 코로나19 유행 전후로 국내 RSV 균주의 유전자형 패턴의 변화를 조사하였다. G 단백질의 유전자형 분류의 결과, RSV-A에서 ON1이었고, RSV-B에서는 BA9에 포함되었다.WGS 분석에서는 RSV-A와 RSV-B의 유전자형은 각각 ON1/NA1과 BA와 밀접하게 군집함을 확인할 수 있었다. Palivizumab에 관해 한개의 돌연변이가 RSV 균주에서 확인되었고 nirsevimab에 대한 저항성과 관련된 돌연변이는 검출되지 않았다. 마지막으로, 초점 감소 중화시험 (Focus reduction neutralization test, FRNT)은 초점 감소를 통해 혈청 검체 내 중화 항체(neutralizationantibody)를 측정하는 방법이다. 본 연구에서는 RSV에 특이적으로 바이러스 적정 감염 시간 및 초점 형성과 계수에 대한 기준을 확립함으로 FRNT 분석을 위한 중요한 기초를 확립할 수 있었다. 본 연구를 통해 구축된 RSV 면역 원성 평가법은 개발 중인 백신의 효능평가에 활용될 수 있으며, 국내 환자 유래 RSV 특징 분석 결과를 국외 유행 RSV와 비교·분석함으로써 향후 국내에 도입될 예정인 RSV 백신의 예방 효과를 예측하여 백신 도입 적정성 평가에 중요한 자료로 기여할 것이다.