Identification of Restoring Effect of Orai1 Inhibitor in Diabetic Nephropathy Using BTBR ob/ob Mouse

Abstract

Diabetic nephropathy (DN) is a leading cause of chronic kidney disease (CKD) worldwide, accounting for approximately half of all cases. Renal fibrosis is the most critical pathological change in DN, and reversing advanced fibrosis is crucial for treating this irreversible and often fatal condition. Orai1, a key component of store-operated Ca2+ entry (SOCE), represents a major Ca2+ influx mechanism in non-excitable cells, including glomerular podocytes, and is proposed as a potential therapeutic target for DN. Recent studies yielded conflicting results regarding SOCE inhibition, with reports of protective effects against or exacerbating renal fibrosis. This study aimed to investigate the significance of Orai1 in human DN and to demonstrate the impacts of Orai1 inhibition in BTBR ob/ob mice, which exhibit morphological and functional changes similar to those observed in human type II diabetes mellitus (DM). Immunohistochemical staining for Orai1 was performed on kidney tissues from 93 patients diagnosed with DN. The significance of Orai1 expression was evaluated in relation to the pathological and clinical parameters of DN using Pearson correlation, univariate logistic regression analysis, and multivariate logistic regression analysis. A 4-week intervention experiment was conducted on 14-week-old BTBR ob/ob mice by administering an Orai1 inhibitor. Essential parameter change, morphological, and functional analysis were performed. In the results of the human study, Orai1 expression was significantly positively correlated with higher RPS grades of DN classification, increased interstitial fibrosis and tubular atrophy (IFTA) scores, and serum creatinine (Cr) levels and CKD stage. There was an inverse correlation between Orai1 expression and estimated glomerular filtration rate (eGFR). Logistic regression analysis showed a significant correlation between high RPS grades and advanced CKD stages. After adjustment, multivariate logistic regression analysis also revealed a strong association with advanced CKD stages. Based on these results, these findings were applied to animal experiments. In the results of the animal study, baseline parameters of the mice were measured, and glomerular basement membrane (GBM) thickness, glomerular volume, and mesangial area were assessed. Podocyte density was quantified and analyzed through immunohistochemical staining for WT-1. Blood samples were collected to measure serum Cr levels, and the urinary albumin-to-creatinine ratio (ACR) was calculated. In the treated BTBR ob/ob mice, no significant effects on body weight, blood glucose, or kidney weight were observed. However, GBM thickness was reduced to the same level as that of the control group in the treated group. Additionally, a tendency for reduced glomerular volume was observed, and mesangial area significantly decreased. Podocyte density was restored, and the number of podocytes per glomerulus increased considerably. The urinary ACR was significantly reduced in the treated BTBR ob/ob mice. In summary, this study demonstrated a strong correlation between Orai1 and clinical and pathological prognostic factors in human DN, indicating its involvement in the development and progression of DN. Based on these findings, the Orai1 blockade intervention experiment in BTBR ob/ob mice showed morphological and functional recovery of DN, suggesting that Orai1 is a meaningful therapeutic target for DN. Furthermore, Orai1 has potential value as a biomarker for the diagnosis, treatment, and prognosis prediction of DN.

당뇨신장병은 전세계적으로 만성 신장병의 약 절반의 원인을 차지하는 대표적인 질환이다. 신장 섬유화는 당뇨신장병에서 가장 중요한 병리학적 변화로 알려져 있으며, 이로 인한 손상은 어려워 불가역적인 것으로 알려져 있다. 그러나 최근에는 이러한 불가역적인 변화를 회복시키는 시도가 진행되고 있다. 대표적인 저장조절 칼슘유입 기전(store-operated Ca2+ entry, SOCE) 인자인 Orai1은 사구체 발세포를 포함한 비흥분성 세포에서 주요한 칼슘유입 기전으로, 당뇨신장병의 잠재적 치료 표적으로 제시되고 있다. 최근 연구에서 SOCE의 차단이 신장섬유화에 대한 보호효과를 보이거나, 또는 악화시킨다는 상반된 연구결과가 보고되었다. 이에 본 연구에서는 인간 당뇨신장병에서 Orai1의 역할을 규명하고, 이를 바탕으로 인간의 제2형 당뇨신장병과 유사한 형태학 및 기능적 변화를 보이는 BTBR ob/ob 마우스 모델에서 Orai1 억제효과를 규명하고자 하였다. 당뇨신장병으로 진단된 93명의 신장 조직을 이용하여 Orai1에 대한 면역조직화학 염색을 시행하였다. Orai1 발현의 중요성은 당뇨신장병의 병리 및 임상적 인자와의 상관관계를 피어슨 상관계수 및 단변량 로지스틱 회귀분석을 통해 평가하였다. Orai1 발현은 높은 신장병리학회 당뇨신장병 분류(RPS 등급), 높은 간질 섬유화 및 세뇨관 위축 점수와 유의한 상관관계가 관찰되었고, 혈청 크레아티닌 수치 및 만성신장질환 단계와 양의 상관관계를 보였다. 추정 사구체여과율(estimated Glomerular Filtration Rate, eGFR)은 Orai1 발현과 역상관 관계가 있다. 로지스틱 회귀 분석에서는 높은 RPS 등급과 고등급 만성신장질환 단계와 유의한 상관관계가 있었으며, 다변량 로지스틱 회귀 분석에서는 고등급 만성신장질환 단계와 강한 연관성을 보였다. BTBR ob/ob 마우스를 이용한 Orai1 억제제 주입에 의한 중재실험에서, 마우스의 기본 인자 측정 후 사구체기저막의 두께와 사구체용적, 메산지움 면적을 측정하였다. 면역조직화학 염색을 통해 발세포 밀도를 정량화하여 분석하였으며, 채취한 혈액에서는혈청 크레아티닌 수치, 소변에서는 알부민-크레아티닌 비율을 계산하였다. BTBR ob/ob 마우스 치료군에서 체중, 혈당, 신장의 무게에는 뚜렷한 영향을 미치지 않았지만, 사구체 기저막 두께가 치료군에서 대조군과 동일한 수준으로 감소하였다. 또한 치료군에서 사구체 용적이 감소되는 경향을 보였고, 메산지움 면적은 유의하게 감소하였다. 발세포 밀도 회복과 사구체당 발세포 수의 유의한 증가를 확인하였다. 치료군에서 소변 알부민-크레아티닌 비율이 유의하게 감소하였다. 요약하면, 인간의 당뇨신장병에서 Orai1은 임상적∙병리학적 예후 인자들과 높은 상관성을 보였으며, 당뇨신장병의 발생 및 진행과 밀접한 연관이 있음을 확인하였다. 이를 바탕으로 BTBR ob/ob 마우스에서 Orai1 차단 중재실험을 통해 형태학적 및 기능적 회복을 보였으며, Orai1이 당뇨신장병 치료에 응용할 수 있는 표적으로 제시할 수 있었다. 나아가 Orai1이 당뇨신장병의 진단, 치료 및 예후예측이 가능한 바이오마커로서 가치가 있음을 강력히 시사한다.