Protective effects of irisin as a myokine on vascular calcification in chronic kidney disease model

Abstract

Background: Vascular calcification is the prevalent complication and an independent predictor of cardiovascular mortality in chronic kidney disease (CKD) patients. The pathogenesis of vascular calcification in CKD is a complex process involving active cell-mediated mechanisms, particularly the transformation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) into osteoblast-like cells. The renin- angiotensin system (RAS) plays a significant role in the pathogenesis of osteogenic transdifferentiation and vascular calcification in CKD, with angiotensin II implicated in its development and progression. Meanwhile, CKD often leads to progressive sarcopenia due to declining renal function, which may further increase cardiovascular risk in this population. The prevention and treatment of muscle wasting in CKD patients should be considered as an important target. Irisin is an exercise-induced myokine derived from its precursor protein, fibronectin type III domain-containing protein 5 (FNDC5). Studies have shown an inverse relationship between serum irisin levels and cardiovascular mortality, suggesting a potential protective role for irisin in vascular health. Irisin may play a critical role in preserving the functional integrity of the vascular endothelium and preventing vascular calcification. Therefore, the present study is aimed to elucidate the potential therapeutic benefits of irisin in mitigating vascular calcification in CKD. Methods: In vitro study, VSMCs were subjected to treatment with or without angiotensin II. The expression levels of osteogenic genes and proteins, including Runx2, BMP2, and OPN, were assessed using real-time PCR and Western blot analysis. Calcium deposition was evaluated using alizarin red staining. VSMCs were cultured with or without angiotensin II, recombinant irisin, and siFndc5 to investigate the effects of irisin on osteogenic transdifferentiation and calcium deposition. CKD mice model was induced by 0.2% adenine diet for up to 6 weeks. Aortic sections were stained with von Kossa to assess calcium deposition. The expression levels of osteogenic genes and proteins were assessed in control and CKD mice. For ex vivo experiments, aortas of CKD mice were harvested and divided into control group (n=4) and calcification induction group (n=16). The aortas of calcification induction group were cultured in calcification induction media for 14 days with or without angiotensin II and recombinant irisin to identify the protective effects of irisin to vascular calcification. Calcium deposition and indicators of osteogenic transdifferentiation were analyzed in aortas of mice. Result: In VSMCs, exposure to angiotensin II led to increased expression of osteogenic genes and proteins, such as Runx2, BMP2, and OPN, as well as enhanced calcium deposition. These changes were significantly mitigated by treatment with recombinant irisin. Additionally, knocking down FNDC5 as a precursor of irisin exacerbated osteogenic transdifferentiation and calcium deposition in VSMCs. In vivo, CKD mice exhibited significantly higher levels of calcium deposition in their aortas compared to control mice. The increased expression of osteogenic markers and the decreased expression of FNDC5 were observed in the aortas of CKD mice. Ex vivo, aortic calcium contents were elevated in calcification induction media with angiotensin II and were alleviated by the presence of recombinant irisin. The exposure to calcification media containing angiotensin II led to an elevation in the levels of osteogenesis-related genes and proteins, however, treatment with recombinant irisin significantly improved these indicators. Conclusion: Present study demonstrated that irisin treatment alleviated calcification and osteogenic transdifferentiation in VSMCs in vitro and ex vivo experiments with separated aortas from CKD mice. These data suggest that irisin could serve as a potential therapeutic strategy for vascular calcification in CKD.

배경: 혈관의 석회화는 만성 신질환 환자들에게 있어서 흔한 합병증이고 심혈관계 사망률을 예측하는 주요한 인자로 알려져 있다. 만성 신질환에서 혈관의 석회화는 능동적인 세포를 매개로 하는 과정을 거쳐서 발생하는데 특히 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells)가 조골세포로 분화하는 과정을 포함한다. 이러한 조골세포로의 분화 (osteogenic transdifferentiation)에 있어서 angiotensin II 가 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 한편, 신기능 악화에 따라서 근감소증을 동반하는 경우가 많은데, 근감소증은 심혈관계 사망률의 증가와 관련이 있고 이에 대한 치료가 만성 신질환 환자에 있어서 중요한 목표로 여겨진다. 운동에 의해서 분비되는 마이오 카인의 일종인 Irisin 은 전구체인 fibronectin type III domaincontaining protein 5 (FNDC5)으로부터 분리되어서 체내로 분비되는데 이전 연구를 통해서 Irisin 의 혈중 농도가 심혈관계 사망률과 음의 상관 관계가 있으며 심혈관 건강에 있어서 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이번 연구에서는 만성 신질환 모델에서 Irisin 이 혈관 석회화에 대해서 억제 효과가 있는지 확인함으로써 향후 만성 신질환 환자의 혈관 석회화에 대한 치료 후보물질로서의 가능성을 확인하고자 한다. 방법: 생체 외 실험으로는 혈관 평활근 세포를 대조군과 angiotensin II 투여군으로 나눠서 조골세포 분화 신호전달체계의 표지자인 Runx2, BMP2, OPN 의 발현 정도를 real-time PCR 과 western blot analysis 로 확인하였고 칼슘 침착은 alizarin red 염색으로 관찰하였다. 혈관 평활근 세포에 recombinant irisin 와 siFndc5를 추가로 투여함으로써 칼슘 침착과 조골세포 분화에 대해서 Irisin 이 억제 효과를 갖고 있는지 확인하였다. 동물 실험을 위해서 마우스에게 0.2% 아데닌 사료를 6주간 투여하여 만성 신질환 모델을 유발하였다. 대조군과 만성 신질환군의 대동맥내 칼슘 침착을 확인하기 위해서 von Kossa 염색을 실시하였고 두 군간 조골분화 정도를 real-time PCR 과 western blot analysis 로 비교하였다. 만성 신질환 마우스의 대동맥을 분리하여서 배양하는 ex vivo 실험을 실시하였는데 대조군과 석회화 유도군으로 나누고, 석회와 유도군은 recombinant irisin 과 angiotensin II 투여 여부에 따라서 4개의 세부군으로 나눠서 칼슘 침착과 조골세포 분화에 대해서 비교 분석하였다. 결과: 혈관 평활근 세포를 이용한 실험에서 대조군과 비교했을 때 angiotensin II 투여군에서 조골세포 분화 신호전달체계의 표지자인 Runx2, BMP2, OPN 의 발현과 칼슘 침착이 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 변화는 recombinant irisin 투여에 의해서 완화되었고 siFndc5 투여에 의해서 악화됨을 확인할 수 있었다. 동물 실험을 실시하여 대조군에 비해서 만성 신질환 마우스에서 혈관 석회화와 조골세포 분화 신호전달체계의 표지자들의 발현이 증가하여 있음을 확인하였다. 만성 신질환 마우스에서 분리한 대동맥을 이용한 ex vivo 실험에서 angiotensin II 투여시 칼슘 침착 및 조골분화 관련 인자들의 발현이 증가함을 확인할 수 있었고 recombinant irisin 투여에 의해서 그 변화가 완화됨을 확인하였다. 결론: 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 만성 신질환 모델에서 Irisin 치료가 혈관 석회화를 완화시킬 수 있음을 확인 할 수 있었다. Irisin 이 만성 신질환 환자들의 혈관 석회화를 억제시킬 수 있는 치료 후보 물질로 여겨지며 향후 추가 연구를 통하여 관련 기전을 규명할 수 있을 것으로 생각된다.