The role of inflammasomes in the pathogenesis of nephrotic syndrome in children

Abstract

INTRODUCTION: Idiopathic nephrotic syndrome (INS), particularly steroid-sensitive nephrotic syndrome (SSNS), is characterized by recurrent proteinuria, necessitating extended steroid therapy. This prolonged treatment often subjects patients to substantial side effects. Although the etiology of SSNS remains poorly understood, this study aimed to explore its pathogenesis with a focus on the role of the inflammasome. METHODS: This study was the first to utilize blood from patients with SSNS in both acute and chronic remission phases of the disease and to stimulate podocytes in vitro, aiming to uncover mechanisms related to inflammasomes. The investigation included patients with a confirmed diagnosis of SSNS, aged 4 to 18 years, who had provided informed consent between 2016 and 2023. Subjects presenting active proteinuria were designated to the acute phase group, whereas those who had sustained a relapse-free state for more than one year without pharmacological intervention were allocated to the chronic remission phase group. During clinical assessments, venipuncture was performed to collect a 7.5 cc blood sample from each participant. Of this, 2.5 cc was stored in liquid nitrogen for subsequent messenger RNA (mRNA) sequencing. For the analysis, aliquots of whole blood from patients in both the acute and chronic remission phases were utilized, with data analyzed using various statistical models. The remaining 5 cc was immediately centrifuged, and the separated serum was cryopreserved in liquid nitrogen at −140 °C for future use in the in vitro culture of human podocytes. Cultured cells were segregated into four distinct groups for experimental manipulation: a control group receiving vehicle alone, a group stimulated with sera from the acute phase, a group treated with acute phase sera concomitantly with dexamethasone (DEX), and a group incubated with sera from the chronic remission phase. After treatment, these podocytes were evaluated for changes in intracytoplasmic actin filaments and subjected to mRNA sequencing. Data derived from these experimental conditions were analyzed using sophisticated statistical modeling to elucidate the molecular underpinnings of SSNS. RESULTS: Analysis of whole blood from patients in the acute and chronic remission phases of SSNS revealed statistically significant differences in genes associated with inflammasomes, including Nod-like receptor (NLR) family caspase activation and recruitment domain containing 4 (NLRC4), nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing family apoptosis inhibitory protein (NAIP), nuclear factor-kappa B1 (NFKB1), and mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14). A total of 3,554 differentially expressed genes (DEGs) were identified between the two groups. Gene ontology (GO) enriched pathway analysis indicated that programmed cell death (PCD), apoptotic processes, cellular biosynthetic processes, and intracellular signal transduction involving the MAPK pathway were upregulated in the acute phase group. Experiments stimulating podocytes with patient sera demonstrated a reduction in intracytoplasmic actin filaments when exposed to acute phase sera, which was reversed upon the addition of DEX, restoring the clarity of actin filament staining. Podocytes treated with acute phase sera and DEX showed significantly reduced expression of caspase 3 (CASP3), interleukin-1β (IL1B), and NFKB1 compared to cells stimulated with acute phase sera alone. Among the 2,153 DEGs identified between the two groups, 79 were found to overlap with the PodNet database. GO enrichment analysis revealed that upregulated DEGs in acute phase sera stimulation were enriched for cytoskeleton organization and supramolecular fiber organization pathways, while downregulated DEGs were enriched in processes such as PCD, apoptotic processes, and metabolic processes. CONCLUSION: This study suggests a significant association of NAIP/NLRC4 inflammasomes, which represent a different pathway from NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), with the pathogenesis of SSNS. NAIP/NLRC4 inflammasomes and related pro-inflammatory cytokines may serve as a potential link between bacterial infections or abnormalities in the immune response and the onset or exacerbation of proteinuria. The imbalance between pro-inflammatory and anti-inflammatory signals can induce pathological changes in podocytes. Further research is needed to elucidate the specific roles and relationships of these substances in nephrotic syndrome and to develop additional therapeutic strategies.

도입: 특발성 신증후군, 특히 스테로이드 반응성 신증후군은 잦은 단백뇨의 재발로 스테로이드를 반복적으로 투여하면서 발생하는 부작용으로 인해 고통을 받는 질환이다. 아직 원인을 잘 알지 못하는 이 질환의 기전을 인플라마좀과 연관하여 찾아보고자 하였다. 방법: 본 연구는 스테로이드 반응성 신증후군 환자의 급성기 및 만성 관해기 혈액을 분석하여 비교하고, 나머지 혈액에서 분리한 혈청으로 인간 족세포를 자극해 실험해 본 최초의 연구이다. 이 연구는 2016년부터 2023년까지 스테로이드 반응성 신증후군으로 진단된 4세 이상 18세 미만 환자들을 대상으로 연구 동의를 받아 진행하였다. 단백뇨가 많이 나오고 있는 환자를 급성기, 약물 치료 없이도 1년 이상 단백뇨 재발이 없는 환자를 만성 관해기로 분류한 뒤 진료를 위해 내원한 환자들을 대상으로 7.5cc 채혈하여 2.5cc는 RNA 시퀀싱 후 결과 데이터를 분석하고 여러 가지 방법으로 통계적 모델링을 진행하였다. 나머지 5cc는 채혈 즉시 혈청을 원심 분리하여 영하 140℃ 액체질소에 보관한 뒤 인간 족세포 실험에 사용하였다. 족세포는 배양 후 운반체(vehicle)로 자극한 그룹, 급성기 혈청으로 자극한 그룹, 급성기 혈청과 덱사메타손으로 함께 자극한 그룹, 만성 관해기 혈청으로 자극한 그룹으로 나누어 동시에 실험하였다. 이후 족세포 내 엑틴(actin) 필라멘트를 염색 후 현미경으로 확인한 뒤 혈청 분석과 마찬가지로 자극한 족세포들을 RNA 시퀀싱 후 결과 데이터를 분석하고 여러 가지 방법으로 통계적 모델링을 진행하였다. 결과: 스테로이드 반응성 신증후군 환자의 급성기 및 만성 관해기 전혈을 비교 분석한 결과 인플라마좀과 관련이 있는 유전자 중 NLRC4, NAIP, NFKB1, MAPK14 유전자들이 통계적으로 유의하게 급성기에서 활성화되어 있었다. 두 그룹간 차이가 나는 차등 발현 유전자들(differentially expressed genes, DEGs)은 3,554개였고 유전자 온톨로지(gene ontology) 농축 분석에서 급성기에서 프로그램화된 세포사 및 세포자멸사 과정, 세포 생물합성 과정 및 세포 내 신호전달 MAPK 경로의 발현이 증가된 것이 확인되었다. 족세포를 환자 혈청으로 자극하는 실험에서는 급성기 혈청으로 자극된 세포는 다른 그룹에 비해 엑틴 필라멘트 감소를 보였고, 급성기 혈청과 덱사메타손을 동시에 처리한 세포는 일부 엑틴 필라멘트 회복이 나타났다. 또한, 급성기 혈청으로만 자극한 족세포 군에 비해 급성기 혈청과 덱사메타손을 동시에 처리한 족세포 군에서 CASP3, IL1B, NFKB1 유전자 활성도가 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 관찰되었다. 두 그룹 간에는 유전자 온톨로지 농축 분석에서 2,153개의 DEGs 차이가 확인되었는데, 이 중에서 79개가 PodNet 데이터베이스와 겹치는 것으로 나타났다. 급성기 혈청으로 자극된 족세포 군에서, 급성기 혈청과 덱사메타손을 함께 처리한 세포 군에 비해 발현이 증가된 DEGs는 세포골격 조직 및 초분자 섬유 조직 관련 경로와 관계가 있었던 반면, 발현이 감소된 DEGs는 프로그램된 세포 사멸, 세포자멸사 및 대사 과정과 같은 경로와 관련이 있었다. 결론: 이 연구는 NLRP3와는 다른 특징을 가지고 있는 NAIP/NLRC4 인플라마좀이 스테로이드 반응성 신증후군의 병인과 중요한 연관성이 있음을 제시한다. NAIP/NLRC4 인플라마좀과 관련된 염증 유발 사이토카인들은 세균 감염이나 면역 반응의 이상으로 인한 단백뇨의 발생 및 악화와 잠재적으로 연결될 수 있으며, 이들이 염증 유발 신호와 항염증 신호 간의 균형을 깨면 족세포의 병리학적 변화로 이어질 수 있다. 향후에는 이러한 물질들의 신증후군에서의 정확한 기능과 상호 작용을 명확히 하고 치료 전략을 세우는 추가적인 연구가 필요하다.